Здесь мы представляем строка Ассамблеи gRNA клонирования (STAgR), метод легко мультиплекс gRNA векторов ТРИФОСФАТЫ/Cas9 подходов. STAgR делает gRNA мультиплексирования простой, эффективной и настраиваемые.
Бактериальные ТРИФОСФАТЫ/Cas9 системы значительно увеличил методологические варианты для жизни ученых. Из-за его использования генетический и геномный техники стала применяться для широкого спектра систем. Кроме того многие транскрипционный анализ и epigenomic инженерные подходы в настоящее время в целом целесообразно в первый раз. Одна из причин для широкой применимости ТРИФОСФАТЫ заключается в его двустороннего характера. Небольшие оформления определить genomic цели комплекса, варианты белка Cas9 и местные молекулярной последствия. Однако многие ТРИФОСФАТЫ подходов зависит от одновременной доставки нескольких оформления в отдельные клетки. Здесь мы представляем настраиваемый протокол для строки Ассамблеи gRNA клонирования (STAgR), метод, который позволяет простым, быстрым и эффективным поколения мультиплексированных gRNA векторы выражения в одном клонирования шаг. STAgR является экономически эффективным, поскольку (в этом протоколе) индивидуальной нацеленности последовательности вводятся короткий свес грунтовки в то время как длинный ДНК шаблоны кассет gRNA выражение может быть повторно использован несколько раз. Кроме того STAgR позволяет один шаг большое количество оформления, а также комбинации различных gRNA вариантов, векторы и промоутеров.
Строка Ассамблеи gRNA клонирования (STAgR) — это метод, позволяя эффективно ночи поколения векторы выражения, содержащие несколько gRNA выражение кассеты в один единый клонирования шаг. Протокол STAgR не зависит от опыта специалиста или материалов и предлагает несколько вариантов для настройки.
Бактериального белка ТРИФОСФАТЫ Cas9 имеет уникальный потенциал. Это возможность найти и избирательно связывают только те последовательности ДНК закодированы в естественно-происходя crRNAs или инженерных оформления1. Его использование как инструмента молекулярной позволило большое количество подходов, которые было невозможно, неосуществимым или ограничивается только определенных клеточных моделей до недавнего времени. К ним относятся целевые ген мутации2, геном инженерных3, epigenome,4,5,6, transcriptional активации и7,8экспрессию гена редактирования. Насколько мы знаем, что ТРИФОСФАТЫ универсально развертываемого, как сообщает его применения существуют для широкого круга целевых сайтов, типы клеток и видов. Однако многие приложения ТРИФОСФАТЫ зависит прямо или косвенно доставки нескольких оформления, включая серию геномной манипуляции (транслокации9,10, средние11 и больших масштабах геномных изменений 12 , 13), геном инжиниринг (использование Cas9 nickases14), поколения условного аллели11,15 или16последовательных мутаций и трассировки стратегии17. Кроме того для других подходов (транскрипционный анализ инженерных18, epigenome, инженерных19,20) несколько таргетинга сайты не являются строго обязательными, однако они достигают их максимальный эффект часто только по этому состояние.
Были описаны несколько полезных методов для создания gRNA векторов, содержащие более одного gRNA выражение кассеты21,22,23,24,25,26, 27. Здесь мы представляем протокол для STAgR, строка Ассамблеи gRNA клонирования, который является выдающимся в своем сочетании простоты и скорости (клонирования шаг необходим только один на ночь), низкой стоимости (как ДНК шаблоны могут использоваться несколько раз), настраиваемость (для различные gRNA систем и промоутеров) и эффективность (это позволяет генерации векторов, содержащих большое количество кассет gRNA)28.
STAgR могут в принципе использоваться для генерации векторов выражения с несколько (1 – 2 оформления), несколько (3 – 5 оформления) и некоторые из наибольшее количество кассет выражение сообщает пока (6 – 8 оформления)28. Аналогично STAgR применяется для любой последовательности gRNA, позвоночника или промоутера. Поскольку, однако, STAgR главным образом на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) и Ассамблеи Гибсон, оформления с высоким последовательность сходства должны создаваться с использованием альтернативного метода.
Здесь мы представляем подробный протокол для STAgR позволяет быстро и просто поколения gRNA выражение плазмид различных размеров. Этот протокол может использоваться для поколения Одношаговая gRNA плазмид с 2-8 gRNA выражение кассеты (с или без двух аптамеры MS2 РНК) в gRNA выражение вектор STAgR_Neo и использование человеческого U6, мыши U6, человеческого 7sK и человека H1 промоутеров28 ,32,33. Если более чем четыре кассеты, рекомендуется использовать по крайней мере два различных промоутера/леска типов для повышения эффективности. Другие векторные, промоутеров и промоутер комбинаций, а также более чем 8 gRNA кассет возможно также; Однако это не тестировалась. Хотя наш опыт метод работает надежно и можно воспроизвести, мы определили важнейшие шаги и стратегии устранения неполадок следует ожидаемый результат не сразу возникают. В нашем опыте некоторые шаги являются ключевыми для успешного подхода: во-первых, важно использовать правильную Молярная соотношения вставок к магистрали вектор на шаг Ассамблеи Гибсон (3:1). Однако мы заметили, что для некоторых наборов gRNA соотношении 1:1 вставок в векторный выгодно, даже когда gRNA кассету более двух. Во-вторых, должен быть достаточно продолжительным период реакции Ассамблеи Гибсон (по крайней мере 45 минут рекомендуется).
STAgR могут быть использованы с большое количество модификаций. Ориентация последовательностей, gRNA чисел и подмости, промоутеров и вектор магистралей могут быть настроены и свободно комбинировать. Однако каждая комбинация может иметь немного разные требования. По нашему опыту, если средний или высокий число gRNA кассеты (> 4) желаемого, но не получили сразу, обычно самый быстрый способ для преодоления этой проблемы является чтобы изменить порядок отдельных gRNA кассет в векторе. Аналогичным образом, сочетая различные gRNA промоутеров и подмости повышает эффективность (и таким образом снижает требуемое количество PCRs колонии, которые должны быть забил) когда клонируются Многие gRNA кассеты. Мы обнаружили, что неправильный клоны обычно создаются спонтанное совместно повторяющихся последовательностей при Гибсон Ассамблеи. Хотя это может снизить эффективность метода, это также приводит к одновременной поколения векторов с функциональной gRNA подмножеств28.
Поколение мультиплексирования gRNA векторов, содержащих более одной кассеты выражение gRNA поступили с целого ряда различных методов21,,2223,24,25, 26,27. В то время как некоторые используют одновременное или последовательное клонирование gRNA пар22,34, другие зависят от Ассамблеи Золотые ворота и несколько последовательных клонирования шаги25,35. Xie et al., применяя эндогенного сотовой системы обработки tRNA сократить несколько оформления из одного прародителя Стенограмма36использовалось особый подход. Advangetage этого метода является требование только один промоутер; недостатком является необходимость заново синтезированные фрагментов ДНК для каждой комбинации gRNA. Каждый gRNA мультиплексирования метод имеет преимущества и недостатки; STAgR сочетает в себе простоту и эффективность, высокое количество возможных gRNA кассет с низкой стоимостью.
STAgR (и другие системы мультиплексирования) скорее всего будет важную роль в обеспечении эффективной (и одновременно) нарушение нескольких генов в естественных условиях, как впервые в zebrafish мозги28. Другое будущее применение gRNA мультиплексирования векторов является обещанием для манипуляции полных транскрипционный анализ программ в отличие от индукционного или подавление единичных генов. Вероятно эти подходы позволят трансформации клеток и органов в будет в гораздо большей степени, чем это возможно сегодня.
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить профессора д-ра Стефана Бек и профессор доктор Йовица Нинкович за их вклад, помощь и поддержку в разработке метода STAgR. Тобиас Klötzer, Анна Köferle и Валентин Бауманн за полезные замечания. Работа была поддержана DFG (STR 1385/1-1).
Phusion High- Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | Polymerase for Gibson Master Mix as well as all PCRs |
dNTPs | Life Technology | R0191 | dNTPs for all PCRs |
dATP | Life Technology | R0141 | dNTPs for Gibson Master Mix |
dCTP | Life Technology | R0151 | dNTPs for Gibson Master Mix |
dGTP | Life Technology | R0161 | dNTPs for Gibson Master Mix |
dTTP | Life Technology | R0171 | dNTPs for Gibson Master Mix |
Agarose | VWR | 443666A | |
DpnI | NEB | R0176S | |
AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | for DNA clean up |
Tris HCL | Roth | 9090.2 | for Gibson Master Mix |
DTT | Life Technology | R0861 | for Gibson Master Mix |
PEG 8000 | VWR | RC- 077 | for Gibson Master Mix |
NAD | Cayman Chemicals Company | 16077 | for Gibson Master Mix |
T5 Exonuclease | NEB | M0363S | for Gibson Master Mix |
Taq DNA Ligase | NEB | M0208S | for Gibson Master Mix |
Ampicilin | SigmaAldrich | PHR1393-1G | |
DNA Ladder 1kb Plus | Thermo Scientific | SM0311 | |
Plasmid Mini Kit | Thermo Scientific | K0503 | |
Plasmid and Primer Sequences | All sequences available at Figshare (https://goo.gl/UGdc3Q). | ||
EDTA | PanReacAppliChem | 6381-92-6 | for TLE Buffer |
MgCl2 | SigmaAldrich | M8266 | for Gibson Master Mix |
Top10 chemically competent bacteria | Thermo Scientific | C404003 | |
S.O.C. Medium | Thermo Scientific | 15544034 | |
Yeast- Extract | SigmaAldrich | Y1625 | for lysogenic broth (LB Media) |
NaCl | SigmaAldrich | S7653 | for lysogenic broth (LB Media) |
Peptone | SigmaAldrich | 91249 | for lysogenic broth (LB Media) |
Agar-Agar | SigmaAldrich | 5040 | for lysogenic broth (LB Media) |
Taq DNA Polymerase | Quiagen | 201203 |