Vi præsenterer her, streng forsamling gRNA kloning (STAgR), en metode til let multiplex gRNA vektorer for CRISPR/Cas9 tilgange. STAgR gør gRNA multiplexing enkle, effektive og kan tilpasses.
Bakteriel CRISPR/Cas9 systemet er steget betydeligt metodiske muligheder for liv forskere. På grund af dens udnyttelse blev genetiske og genomiske engineering gældende for en lang række systemer. Desuden, mange transcriptional og epigenomiske engineering tilgange er nu generelt muligt for første gang. En af grundene til den brede anvendelse af CRISPR ligger i den todelte karakter. Små gRNAs bestemme genomisk målene i komplekset, varianter af protein Cas9 og de lokale molekylære konsekvenser. Mange CRISPR tilgange afhænger imidlertid af den samtidige levering af flere gRNAs i enkelte celler. Her præsenterer vi en tilpasselig protokol for streng forsamling gRNA kloning (STAgR), en metode, der giver mulighed for enkel, hurtig og effektiv generation af multipleksede gRNA udtryk vektorer i en enkelt kloning trin. STAgR er omkostningseffektive, siden (i denne protokol) de individuelle målretning sekvenser er indført af korte udhæng primere, mens de lange DNA skabeloner af gRNA udtryk kassetter kan genanvendes flere gange. Desuden tillader STAgR trinvist inkorporering af et stort antal gRNAs samt kombinationer af forskellige gRNA varianter, vektorer og initiativtagere.
Streng forsamling gRNA kloning (STAgR) er et middel, der muliggør effektiv overnight generation udtryk vektorer der indeholder flere gRNA udtryk kassetter i én enkelt kloning trin. STAgR-protokollen afhænger ikke af specialist ekspertise eller materialer og tilbyder flere muligheder for tilpasning.
Den bakterielle CRISPR protein Cas9 har en enestående kapacitet. Det er i stand til at finde og selektivt binde kun disse DNA-sekvenser kodet i naturligt forekommende crRNAs eller manipuleret gRNAs1. Dens udnyttelse som en molekylær værktøj har muliggjort en lang række tilgange, der var umuligt, umuligt eller kun begrænset til visse cellulære modeller indtil for nylig. Disse omfatter målrettede gen mutationer2, genom engineering3, epigenome redigering4,5,6, transcriptional aktivering og genhæmning7,8. Så vidt vi ved CRISPR er universelt indsættelige, som rapporter fra dens anvendelse findes for en lang række målwebsteder, celletyper og arter. Men mange CRISPR programmer afhænger direkte eller indirekte levering af flere gRNAs, herunder en række genomisk manipulationer (omplantninger9,10, medium11 og storstilet genomisk ændringer 12 , 13), genom engineering (brug af Cas9 nickases14), generation af betingede alleler11,15 eller seriel mutationer16og sporing strategier17. Desuden, for andre tilgange (transcriptional engineering18, epigenome engineering19,20) flere målretning websteder ikke er strengt obligatoriske, men de når deres maksimale virkning ofte kun under denne betingelse.
Flere nyttige metoder er blevet beskrevet til at generere gRNA vektorer som indeholder mere end én gRNA udtryk kassette21,22,23,24,25,26, 27. Vi præsenterer her, en protokol for STAgR, string forsamling gRNA kloning, som er enestående i sin kombination af enkelhed og hastighed (kun én overnatning kloning trin er nødvendigt), lav pris (som DNA skabeloner kan genbruges flere gange), customizability (for forskellige gRNA systemer og promotorer) og effektivitet (det giver mulighed for generation af vektorer indeholdende højt antal gRNA kassetter)28.
STAgR kan principielt bruges til at generere udtryk vektorer med par (1-2 gRNAs), flere (3-5 gRNAs) og nogle af de højeste antal udtryk kassetter rapporteret hidtil (6 – 8 gRNAs)28. STAgR er ligeledes gældende for gRNA sekvens, rygraden eller promotor. Da imidlertid STAgR er hovedsageligt baseret på polymerase kædereaktion (PCR) og Gibson forsamling, skal gRNAs med høj sekvens ligheder genereres ved hjælp af en alternativ metode.
Her præsenterer vi en detaljeret protokol for STAgR giver mulighed for hurtig og enkel generation af gRNA udtryk plasmider i varierende størrelser. Denne protokol kan bruges til et-trins generation af gRNA plasmider med 2 – 8 gRNA udtryk kassetter (med eller uden to MS2 RNA aptamers) i gRNA udtryk vektor STAgR_Neo og anvendelse af menneskelige U6, mus U6, menneskers 7sK og menneskelige H1 initiativtagere28 ,32,33. Hvis mere end fire kassetter er ønsket, anbefales det at bruge mindst to forskellige promotor/stillads typer til at øge effektiviteten. Andre vektorer, initiativtagere og promotor kombinationer samt mere end 8 gRNA kassetter kan være realistisk så godt; dog er dette ikke blevet testet. Selvom vores erfaring metoden fungerer pålideligt og reproducerbar, vi har bestemt kritisk trin og fejlfinding strategier bør det forventede resultat ikke umiddelbart forekomme. I vores erfaring nogle trin er afgørende for succes af tilgangen: først og fremmest, det er vigtigt at bruge de korrekte molære forhold af skær til vektor rygraden på Gibson forsamling trin (3:1). Vi bemærkede imidlertid, at for nogle gRNA sæt forholdet 1:1 af skær til vektor er gavnlige, selv når gRNA kassette antallet overstiger to. For det andet, perioden af Gibson forsamling reaktion bør være tilstrækkelig lang (mindst 45 min anbefales).
STAgR kan være ansat med et stort antal ændringer. Målretning sekvenser, gRNA kan numre og stilladser, initiativtagere og vektor backbones tilpasset og frit kombineres. Hver kombination kan dog lidt anderledes krav. Vores erfaring, hvis medium eller høj numre af gRNA kassetter (> 4) er ønsket, men ikke opnået straks, normalt den hurtigste måde at overvinde dette problem er at ændre rækkefølgen af de enkelte gRNA kassetter i vektoren. På samme måde, ved at kombinere forskellige gRNA initiativtagere og stilladser forbedrer effektiviteten (og dermed sænker det krævede antal koloni PCR’er, der har at blive scoret) hvor mange gRNA kassetter er klonet. Vi fandt, at forkert kloner af den spontane sammen af gentagne sekvenser genereres normalt under Gibson forsamling. Selv om dette kan reducere effektiviteten af metoden, resulterer det også i den samtidige generation af vektorer med funktionelle gRNA delmængder28.
Generation af multiplexing gRNA vektorer som indeholder mere end én gRNA udtryk kassette er blevet rapporteret med en række forskellige metoder21,22,23,24,25, 26,27. Mens nogle anvender samtidige eller sekventiel kloning af gRNA par22,34, afhænger andre af Golden Gate forsamling og flere sekventielle kloning trin25,35. En særlig tilgang er blevet brugt af Xie et al., ved at ansætte den endogene cellulære tRNA forarbejdningssystemet at skære flere gRNAs ud af en enkelt stamfader udskrift36. Advangetage af denne metode er kravet om kun én promotor; Ulempen er behovet for nyligt syntetiserede DNA fragmenter for hver gRNA kombination. Hver gRNA multiplexing metode har fordele og ulemper; STAgR kombinerer enkelhed med effektivitet, høj antallet af mulige gRNA kassetter med lave omkostninger.
STAgR (og andre multiplexing systemer) vil sandsynligvis være medvirkende til at aktivere effektiv (og samtidige) afbrydelse af flere gener i vivo, som var pioner i zebrafisk hjerner28. En anden fremtidig anvendelse af gRNA multiplexing vektorer er lovende for manipulation af komplet transcriptional programmer i modsætning til induktion eller undertrykkelse af enkelt gener. Sandsynligt, disse tilgange giver mulighed for omdanne celler og organer på vil i langt højere grad end det er muligt i dag.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Prof. Dr. Stephan Beck og Prof. Dr. Jovica Ninkovic for deres input, hjælp og støtte i udviklingen af STAgR metoden. Tobias Klötzer, Anna Köferle og Valentin Baumann til nyttige kommentarer. Arbejdet er blevet støttet af DFG (STR 1385/1-1).
Phusion High- Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | Polymerase for Gibson Master Mix as well as all PCRs |
dNTPs | Life Technology | R0191 | dNTPs for all PCRs |
dATP | Life Technology | R0141 | dNTPs for Gibson Master Mix |
dCTP | Life Technology | R0151 | dNTPs for Gibson Master Mix |
dGTP | Life Technology | R0161 | dNTPs for Gibson Master Mix |
dTTP | Life Technology | R0171 | dNTPs for Gibson Master Mix |
Agarose | VWR | 443666A | |
DpnI | NEB | R0176S | |
AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | for DNA clean up |
Tris HCL | Roth | 9090.2 | for Gibson Master Mix |
DTT | Life Technology | R0861 | for Gibson Master Mix |
PEG 8000 | VWR | RC- 077 | for Gibson Master Mix |
NAD | Cayman Chemicals Company | 16077 | for Gibson Master Mix |
T5 Exonuclease | NEB | M0363S | for Gibson Master Mix |
Taq DNA Ligase | NEB | M0208S | for Gibson Master Mix |
Ampicilin | SigmaAldrich | PHR1393-1G | |
DNA Ladder 1kb Plus | Thermo Scientific | SM0311 | |
Plasmid Mini Kit | Thermo Scientific | K0503 | |
Plasmid and Primer Sequences | All sequences available at Figshare (https://goo.gl/UGdc3Q). | ||
EDTA | PanReacAppliChem | 6381-92-6 | for TLE Buffer |
MgCl2 | SigmaAldrich | M8266 | for Gibson Master Mix |
Top10 chemically competent bacteria | Thermo Scientific | C404003 | |
S.O.C. Medium | Thermo Scientific | 15544034 | |
Yeast- Extract | SigmaAldrich | Y1625 | for lysogenic broth (LB Media) |
NaCl | SigmaAldrich | S7653 | for lysogenic broth (LB Media) |
Peptone | SigmaAldrich | 91249 | for lysogenic broth (LB Media) |
Agar-Agar | SigmaAldrich | 5040 | for lysogenic broth (LB Media) |
Taq DNA Polymerase | Quiagen | 201203 |