前のヴィヴォ角膜器官培養モデルの創傷治癒の研究
Summary
元のプロトコル vivo 角膜器官培養モデル創傷治癒の研究を説明に役立ちます。このモデル系は、再生治癒を促進するエージェントまたは整頓されていた 3 D 細胞環境で薬物の毒性の影響を評価するために使用できます。
Abstract
角膜は、創傷治癒過程を研究するモデル システムとして広く使用されています。生成し、2 次元 (2 D) および 3 次元 (3 D) 文化の主な哺乳類細胞を活用する能力は、角膜の生物学についてだけでなく、創傷治癒、myofibroblast 生物学と一般的に瘢痕についての情報の富を生成して.プロトコルの目的は、瘢痕を特徴づける myofibroblast 開発を定量化するための分析システムです。豚の目を使用してモデル前のヴィヴォ角膜オルガン文化を紹介します。この前方の角膜切除の傷、トレフィンと呼ばれる円形翼で世界中でまだ角膜を負傷しています。上皮、基底膜、実質の前方の部分など、前方の角膜の約 1/3 のプラグインが削除されます。負傷後、角膜が世界中からカットがコラーゲン/寒天ベースのマウントされ、居住者線維芽細胞細胞増殖と細胞外マトリックスの分泌を増やすために安定化ビタミン C と補われる血清の自由な媒体で 2 週間培養しました。前歯の間質の芽の活性化は、治癒後の角膜で明らかです。このモデルは、傷口の閉鎖、毒物学、芽や線維化マーカーの開発を試金するために使えます。さらに、遺伝子の打撃のための脂質を介した siRNA トランスフェクションと同様、小分子阻害剤の効果は、このシステムでテストできます。
Introduction
傷害、外傷、または感染症による角膜の瘢痕混濁と永久的な視力喪失を衰弱する可能性があります。従って、治療的介入の対象とすることができます経路を識別するために重要な必要性があります。現在の治療法の選択肢は限定されており、主に角膜移植、世界中で患者へのアクセスが。人間 (図 1) と動物角膜を 2次元のため活用し、3 D 細胞培養研究1,2。アイ ・ バンクや一元的な組織銀行 (国立病研究インターチェンジ (NDRI)) からひと死体角膜移植に適していないを取得でき、動物の目と畜場から入手できます。主な角膜上皮細胞、間質線維芽細胞、さらに最近、血管内皮細胞分離および創傷治癒のためのこれらの組織から培養でき、毒物学研究3,4,5。まばゆいばかりの眼疾患の分子基盤を理解することの重要性、組織および培養細胞機能のアクセシビリティが加え角膜に関する重要なモデル システム。角膜瘢痕通常の角膜は透明で、混濁や線維性瘢痕 (文献6) 傷の特定の種類を作成するようにエージェントの影響をテストに最適です。また、いくつか生体内で角膜創傷治癒モデルは、研究1の瘢痕のため広く用いられています。Ex より利用されている生体角膜創傷治癒のモデル7,8ここで詳細に記述します。このメソッドの目的は 3 D の細胞の線維化のメーカーによって特徴付けられる瘢痕の成果を定量化、ex vivo モデル システム角膜。
通常上皮基底膜を違反しない角膜上皮負傷 24 72 h9内を閉じます。負傷後すぐに端上皮の細胞は、拡散と上皮バリア機能を再確立するため、上皮自由表面に移行を開始します。このアクティビティは、最初と、上皮細胞質量10,11の回復を達成するために外側の輪部のゾーンに位置する前駆細胞の後の段階で順番に角膜基底細胞増殖の活性化が続きます。これらの傷はしばしば傷つかないで直る。しかし、しばしば間質に基底膜を貫通する傷は瘢痕形成1で結果します。角膜実質負傷後骨髄由来線維細胞12,13,14と同様、居住者間質細胞の分化を含む複数の起源の細胞質が表示されます。線維性瘢痕治癒創傷に芽の持続性が特徴です。これらの病理学的芽を示す焦点接着斑、収縮の α-平滑筋アクチン (α SMA) ストレスファイバーと細胞外マトリックス (ECM) の地域活性化におけるインテグリンの蓄積により粘着性が向上-隔離潜熱変換成長因子 β (TGFβ)。間葉転換 (EMT) 上皮として知られている上皮由来細胞の分化も瘢痕形成6に貢献するかもしれない。
負傷した後に細胞の分化とアポトーシスとの間の微妙なバランスがあります。基底膜の違反のための成長因子血小板由来成長因子 (PDGF) と涙から TGFβ と上皮入浴、実質 TGFβ の活性化、持続的な散逸 myofibroblast 分化誘導などとまとまりのない線維性 ECM15,16の分泌。治癒の傷で芽の永続性は、ヘイズと (図 2) 角膜に瘢痕化を促進します。しかしで再生治癒創芽を開発、彼ら apoptose したがって、不在であるまたは (参照6,10レビュー) 治癒組織で大幅に減少番号。したがって、線維性瘢痕に関する研究は、過剰な myofibroblast の開発や myofibroblast の永続性17,18を防ぐ分子をターゲットに少なくとも部分的にきました。Myofibroblast 永続化は、すべて組織19瘢痕および線維症を特徴として、ので角膜は線維化の一般的な細胞メカニズムを研究するモデル システムとして役に立つかもしれません。
モデル体制で世界でトレフィンと呼ばれる円筒形の刃を持つ角膜が負傷しました。人間と豚の角膜については、いずれか、6 または 7 mm トレフィン; で負傷してください。ウサギ角膜 6 mm トレフィンが適しています。豚角膜は、人間の角膜のサイズに近いです。コスト効果的かつ大量にすぐに利用できるので豚角膜、器官培養を日常的に使用されます。さらに、抗体と人間と反応させて Sirna の豚7交叉反応性が一貫しています。負傷後角膜カットされ角膜輪部と世界中からそのまま寒天/コラーゲン ベースにマウントされているとします。角膜は、メディアの無血清培養、さらに線維芽細胞増殖と ECM 蒸着20をシミュレートするためにビタミン C を安定化します。血清添加も成長因子7myofibroblast 形成を誘導するために必要です。角膜は定期的に固定し、文化の 2 週間後組織学のための処理します。遺伝子ノックダウンまたはエージェントの創傷治癒に及ぼす影響をテストするのには、7人が負傷した後傷口に siRNA の傷を扱うことができるまたはメディア、それぞれ8に可溶性のエージェントを追加できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、成層の 3 D 環境の創傷治癒過程を研究するためのモデルについて説明します。コストだけでなく、生きている動物を減らす手順器官培養の細胞培養と生体内での研究の間中間物としての使用を大幅に削減します。他の 3 D モデル自己主ひと角膜線維芽細胞2またはこれらの同じ細胞から作られたコラーゲン ・ ゲルの合成を含むフィールドに大きな恩恵を…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ネイ NIH R01 EY024942、失明を防ぐため、北部医療大学無制限研究資金に研究によって支えられたおよびパラフィン切片の画像解析およびライオンズ地区 20, 顕微鏡顕微鏡コアで行われた、Biorepository シナイ山で、Icahn 医学部病理コアでの組織学的のスライドの準備を行った。
Materials
| PBS | Gibco | 10-010-023 | |
| Pen Strep | MP Biomedicals | 91670049 | |
| Bovine Collagen Solution | Advance Biomatrix | 5005 | |
| Pig eyes with lids attached | Pel-freeze, Arkansas | N/A | |
| 6.0 mm trephine | Katena | K28014 | |
| Surgical Blade | Personna | 0.009 | |
| Small scissor | Fisher | 895110 | |
| Forceps | Fisher | 08953-F | |
| Kim Wipes | Kimberly-Clark™ 34120 | 06-666 | |
| 60 mm cell culture dishes | Falcon | 08-772B | |
| Supplemented Serum- Free media (SSFM) | Add all of the following components to DMEM/F-12: ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C. | ||
| DMEM/F-12 | Gibco | 11330 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma | I3146 | 100X |
| RPMI 1640 Vitamins Solution | Sigma | R7256 | 100X |
| Glutathione | Sigma | G6013 | Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing. |
| 1% L-glutamine solution | Gibco | 25030-081 | 100X |
| MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140 | 100X |
| MEM Sodium pyruvate solution | Gibco | 11360 | 1 M Stocks (1000X) and freeze in single use aliquits. Use from freezer each time media is made. |
| ABAM | Sigma | A7292 | 100X |
| Gentamicin | Sigma | 30-005-CR | 200X |
| Vitamin C | Wako | 070-0483 | 2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x) |
| 10% Iodine | Fisher Chemical | SI86-1 | |
| Tissue Path Cassettes | Fisher | 22-272416 | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Jackson Immuno Research | 005-000-121 | We use 3% NGS |
| Mounting Media | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
| Safe Clear | Fisher | 314-629 | |
| Ethyl Alcohol | Ultra Pure | 200CSGP | 200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%) |
| Sodium citrate | Fisher | BP327 | 10mM, pH 6.4 |
| Hematoxylin | EMD Millipore | M10742500 | |
| Bluing agent | Ricca Chemical Company | 220-106 | |
| 1% Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | Diluted in PBS |
| 0.1% Tween 20 | Fisher | BP337 | Diluted in PBS |
| 3% Hydrogen Peroxide | Fisher | H324 | |
| DAB Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL |
| Parafilm | Bermis | 13-374-12 | |
| Moist Chamber | Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it. | ||
| Lipofectamine 2000 | |||
| Qiagen RNAprotect Cell Reagent | Qiagen | 76104 | |
| Ambion PureLink RNA Mini Kit | Thermo Scientific | 12183018A | |
| Anti-Fibronectin-EDA Antibody | Sigma | F6140 | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum |
| Anti-alpha smooth muscle actin Antibody | Sigma | A2547 or C6198 (cy3 conjugated) | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum |
| Permafluor | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
| DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Invitrogen | 62-6520 | 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining) |
| Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Scientific | PA1-85999 | 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining) |
| Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3 | Jackson Immuno Research | 115-165-146 | 1:200 Diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining) |
| Zeiss Axioplan2 | Zeiss | Microscope | |
| SPOT-2 | Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan | CCD camera | |
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