Qui presentiamo una tecnica di iniezione intratecale diretto utilizzo 1% lidocaina cloridrato in una soluzione virale per garantire una consegna efficiente virus adeno-associato ai piccoli animali e stabilire un sistema di scoring per predire l’efficienza di trasduzione in zona centrale sistema nervoso secondo il grado della debolezza transitoria indotta da lidocaina.
Iniezione intratecale (IT) di virus adeno-associato (AAV) ha attirato notevole interesse nella terapia genica CNS in virtù della sua sicurezza, invasività ed eccellente trasduzione efficacia nello SNC. Precedenti studi hanno dimostrato la potenza terapeutica della terapia genica AAV-consegnato nei disordini neurodegenerative da essa amministrazione. Tuttavia, sono stati segnalati alti tassi di guasto imprevedibile a causa dei limiti tecnici di amministrazione IT nei piccoli animali. Qui, abbiamo stabilito un sistema di scoring per indicare la misura del successo della puntura lombare in piccoli animali con l’aggiunta di 1% lidocaina cloridrato nella soluzione di iniezione. Più ulteriormente indichiamo che l’estensione della debolezza transitoria dopo l’iniezione può prevedere l’efficienza di trasduzione di AAV. Così, questo metodo di iniezione IT può essere utilizzato per ottimizzare le prove terapeutiche in modelli murini di malattie del SNC che affliggono vaste regioni del SNC.
AAV possono mediare l’espressione genica a lungo termine e diffuso nella trasduzione del CNS con pochi effetti collaterali e quindi è diventato uno dei veicoli più promettenti per la terapia genica per il trattamento di malattie del SNC tra cui la sclerosi laterale amiotrofica (ALS), Huntington malattia di s (HD), morbo di Alzheimer (annuncio), malattie da accumulo lisosomiale (LSD), malattia di Gaucher (GD) e Lipofuscinosi ceroido (NCL)1. Attualmente, più di 100 AAV sierotipi sono stati isolati dagli esseri umani e animali. Tra questi, almeno 12 sono stati utilizzati in studi preclinici e clinici, tra cui i più comunemente utilizzati vettori del gene come AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 e rAAVrh.101,2,3,4, 5,6.
Diverse malattie del SNC richiedono diverse strategie di consegna AAV a causa delle varie regioni colpite CNS e tipi di cellule. Le regioni dello SNC e la cella tipi che possono trasdurre AAV varia a seconda del sierotipo così come il metodo di consegna. Ad esempio, rAAVrh10 è stato indicato di trasdurre principalmente astrociti quando consegnato da iniezione sistemica per via endovenosa (IV), considerando che esso trasdotte sia i neuroni e cellule gliali quando consegnato dall’iniezione intratecale4,7. Inoltre, parenchima iniezione ha provocato nella trasduzione del locale alla vicinanza del sito di iniezione, mentre iniezione nel fluido cerebrospinale (CSF) attraverso intraventricolare o iniezione intratecale ha provocato diffuso trasduzione del CNS8 . Gli studi hanno anche dimostrato potenza terapeutica della terapia genica AAV-consegnato nei disordini neurodegenerative da esso amministrazione9,10,11. In malattie che colpiscono vaste aree del SNC quali ALS, iniezione intratecale nel CSF è stato indicato per coprire la maggior parte delle aree che sono afflitti dalla malattia con una dose più bassa, rispetto a un metodo di consegna sistemica4,10. Recenti studi hanno inoltre dimostrato che la puntura lombare può essere usata per iniettare AAV in modelli murini per la SLA, che evita potenziali infortuni connessi con laminectomy e intrathecal cateterizzazione4.
Puntura lombare diretta sperimentale fu usata per trasportare gli agenti, soprattutto anestetici, al midollo spinale per analgesia e anestesia in 188512,13. In questo rapporto, illustriamo la puntura lombare metodo di iniezione di IT in topi adulti con l’ausilio di cloridrato di 1% della lidocaina, un anestetico locale di ammide derivata, della soluzione di iniezione per valutare e monitorare la qualità di iniezione. Iniezioni di successo furono segnate da paralisi transitoria indotta da lidocaina, mentre le iniezioni non riuscite non hanno mostrato questo comportamento. Abbiamo classificato il livello di debolezza transitoria come uno dei cinque gradi per contribuire a predire l’efficacia dell’iniezione. Infine, indichiamo che il livello di trasduzione rAAVrh10 può essere previsto per il grado di paralisi. Pertanto, questo metodo di consegna intrathecal AAV può essere utilizzato per migliorare la consegna del gene AAV-mediata per la terapia sperimentale delle malattie del SNC.
Tecnicamente, ci sono diversi passaggi critici durante l’iniezione di IT in topi svegli. In primo luogo, adeguato controllo gesto e studio dei topi in tutta l’intera operazione è un prerequisito per il recapito corretto. In secondo luogo, il punto più difficile è sentimento lo spazio intervertebrale con la punta dell’ago, come è necessario non inserire troppo profondamente senza resistenza o inserire forzatamente sotto forte resistenza nel caso di ferire gli animali o piegare la punta dell’ago. In terzo luogo, anche …
The authors have nothing to disclose.
Quest’opera è stata finanziata da una sovvenzione da HEBEI Provinciale Dipartimento delle risorse umane e della previdenza sociale (CY201605) e una sovvenzione dalla Fondazione di Hebei Provincia di scienze naturali (H2017206101), e siamo molto grati al Dr. per Guangping Gao, che hanno fornito l’AAV per Questo studio.
FVB/NJ mice | Charles River Laboratories China | ||
Lidocaine hydrochloride monohydrate | HEOWNS | 73-78-9 | |
AAV | Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School | ||
25µL Hamilton syringe/27-30g needle | GASTIGHT | 1702 | |
O.C.T compond | SAKURA | 4583 | |
H 2O 2 | SHUI HUAN PAI | 170401 | |
Goat serum | Solarbio | S9070 | |
Triton X-100 | LIFE SCIENCES | T8200 | |
Rabbit anti-GFP | Life tech | G10362 | 1:333 dilution |
The second antibody (goat-anti rabbit) | Jackson Immuno Research | 111-005-144 | 1:1000 dilution |
VECTASTAIN ABC REAGENT | Vector Lab | PK-6100 | |
ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Lab | SK-4105 | |
Mounting medium for fluorescence with DAPI | Vectorshield | H-1200 | |
NaCl | Yong Da Chemical | ||
NaH2PO4·2H2O | Yong Da Chemical | ||
Na2HPO4·12H2O | Yong Da Chemical | ||
Paraformaldehyde | Yong Da Chemical | 307699 | |
Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 17083 | 25*75 mm |
SUPER-SLIP MICRO-GLAS | Electro Microscopy Siences | 72236-60 | 24*60 mm |
15 ml Centrifuge tube | CORNING | 430790 | |
96 well cell culture cluster | Coster | 3599 | |
24 well cell culture cluster | Coster | 3524 | |
70% Ethanol | WEN ZHI | ||
Gauze | Wei AN | 05171112 | 8cm*10cm*12cm |
1mL syringe | Hong Da | ||
Microtubes | Plasmed | ||
Micropipet | eppendorf | ||
Peppet tips | Rainin | ||
Centirifuge | eppendorf | 5427R | |
Regerator | Haier | BCD-539WT | |
Filter | MILLEX GP | R4PA42342 | |
Pump | LongerPump | BT-100-2J/YZ1515X | |
Microscope | Olympus | BX53 | |
Freezing-microtome | Leica | CM1520 |