Här beskriver vi en cell-baserad analys för att bedöma kvantitativt tau upptag av mikroglia med syftet att skapa ett prövningsläkemedel verktyg att bättre karaktärisera verkningsmekanismer av anti tau antikroppar.
Alzheimers sjukdom (AD) är en progressiv neurodegenerativ tillstånd där aggregerade tau och amyloid proteinerna ansamlas i hjärnan och orsaka neuronal dysfunktion vilket så småningom leder till försämring av kognitiva funktioner. Hyperphosphorylated tau aggregat i neuron tros orsaka de flesta av patologin associerade med AD. Dessa aggregat är antas släppas ut i det extracellulära utrymmet och tas upp av intilliggande friska nervceller där de kan orsaka ytterligare tau aggregering. Denna ”prion-liknande” sprida kan avbrytas av antikroppar som kan binda och ”neutralisera” extracellulära tau aggregat som visas i prekliniska musmodeller av AD. En av de föreslagna mekanismer genom vilka terapeutiska antikroppar minska patologi är antikroppsmedierad upptag och clearance av patologiska aggregerade former av tau av mikroglia. Här beskriver vi en kvantitativ cell-baserad analys för att bedöma tau upptag av mikroglia. Denna analys använder mus mikrogliala cell linjen BV-2, möjliggör hög specificitet, låg variabilitet och medelstora genomströmning. Data som genereras med denna analys kan bidra till en bättre karakterisering av anti tau antikropp effektor funktioner.
Alzheimers sjukdom (AD) är en progressiv neurodegenerativ tillstånd som kännetecknas av en conformationaländring och självmontering av amyloid β peptid och tau protein till patologiska aggregat. Den normala lösliga amyloid β peptiden omvandlas till Oligomera och fibrillar amyloid β, medan onormalt fosforyleras tau ackumuleras som oligomerer och fibrillnystan1,2. Dessa protein aggregat orsakar nervcellernas död leder till minnesförlust och efterföljande progressiv kognitiv försämring. Andra faktorer, inklusive icke-produktiva neuroinflammation och en minskad förmåga att rensa felveckning proteiner, kan förvärra och påskynda sjukdom. För närvarande, åtgärdsstrategier mot AD ger huvudsakligen symtomatisk lindring, men det finns ingen sjukdomsmodifierande bota eller förebygga.
Ökande bevis föreslår en nyckelroll av hyperphosphorylated tau aggregat i patologi AD. I sitt icke-patologiska tillstånd har tau ett inbyggt ovikta protein som binder till mikrotubuli och främjar deras församling i neuronala cytoskelettet. När tau blir hyperphosphorylated, det lossnar från cytoskelettet och kluster i tau aggregat i neuron, som tros orsaka de flesta av patologin associerade med AD3. Aggregerade tau börjar ansamlas intracellulärt först, men eftersom sjukdomen fortskrider, förutsätts det för att släppas från drabbade nervceller i det extracellulära utrymmet, som det kan tas av intilliggande eller synaptically anslutna friska nervceller i en ” Prion-liknande sätt ”. En gång internaliserat, inducerar tau summan ytterligare tau aggregering via mallade conformationaländring4.
Enligt denna hypotes, kan terapier kan avbryta tau sådd bromsa eller vända tau-medierad neurodegenerativa sjukdomsförlopp. Till stöd för detta visar möss mottagliga för tauopathy av genetisk mutation och passivt injiceras med anti tau antikroppar minskad tau patologi och förbättrad kognitiv funktion5,6,7,8 ,9. Dock fortfarande de mekanismer genom vilka terapeutiska antikroppar minska patologi gäckande.
En av de föreslagna mekanismerna är antikroppsmedierad upptag och clearance av patologiska aggregerade former av tau av mikroglia, hjärnans bosatt immunceller. Senaste publikationer föreslår att mikroglia kan effektivt internalisera och försämra patologiskt tau arter och denna förmåga förbättras av anti tau antikroppar via en Fc-beroende mekanism som involverar Fc-receptorer uttrycks på ytan av mikroglia och receptor medierad fagocytos10,11. Dessa uppgifter identifierar mikroglia som potentiellt viktiga effektorer av terapeutiska antikroppar.
Vi beskriver häri en cell-baserad analys för att bedöma kvantitativt tau upptag av mikroglia. Data som genereras med denna analys kan hjälpa till att belysa verkningsmekanismer av anti tau antikroppar som alltså representerar ett användbart verktyg att avancera mot tau antikroppar till ytterligare steg i sin utveckling som potentiell AD behandling.
Mikroglia, bosatt hjärnans immunceller, har nyligen identifierats som viktiga aktörer i antikroppsmedierad behandlingsmetoder för tauopathies10,11. Antikroppsmedierad tau clearance av mikroglia, tillsammans med blockering av neuronala upptag9, hämning eller destabilisering av fibrillcellulosa bildandet13,14 och clearance av intraneuronala fibriller via den lysosomala väg15, kan alla bidra till anti tau antikropp effekten observerades i musmodell tauopathy5,6,7,8,9.
Vi beskrivs här en cell-baserad analys för att bedöma kvantitativt tau upptag av mikroglia med syftet att skapa ett prövningsläkemedel verktyg att bättre karaktärisera verkningsmekanismer av anti tau antikroppar.
Denna analys, anpassad från Funk et al. 11, använder BV-2 celler, som förevigade murina mikrogliaceller. Medan de inte kan helt jämföras med primära mikrogliaceller, de har många av egenskaperna hos primära mikroglia, inklusive möjligheten för kraftfullt phagocytose både Aβ och tau fibriller11,16,17 ,18,19. Dessutom visade de en reproducerbar beteende i vitro som gjorde dem mycket lämpliga för test utveckling och kvantitativa studier, som kräver minimal experimentella variabilitet. Bredvid denna, förevigade cellinjer tillåta högre assay genomströmning och eliminera behovet av djuroffer jämfört med användning av primära mikroglia.
Tau aggregaten vi använt i denna analys erhölls med mycket reproducerbara in vitro- aggregering procedur att vi nyligen beskrivit13och Visa liknande morfologi för att paras ihop spiralformade filament (PHFs) isolerade från hjärnan hos AD patienter. Medan vi inte observera några oväntade resultat som kan ha orsakats av tau aggregat adherencen till plast eller glas ytor, spelade användning av stabila och väl karakteriserade tau aggregat en avgörande roll i denna analys reproducerbarhet.
En annan aspekt som väsentligt bidragit till assay reproducerbarhet var cell densiteten. Antalet celler per brunn beskrivs i protokollet representerar optimal cell densiteten i de beskrivna förhållandena.
Olikt än vilken Funk et al. 11 beskrivs, vi märkt tau aggregat med en pH-känsliga färgämne som avsevärt ökar dess fluorescens vid internaliseringen i sura organeller, vilket möjliggör för intracellulära kvantifiering. Detta, tillsammans med trypsin rötning av yta bundna immunocomplexes eller tau, garantier fluorescens signalen mäts av flödescytometri är resultatet av tau upptag i stället för bindning till cellulära ytan. Dessutom förutsätter en pH känsliga dye underlättar upptäckt av internaliserade tau aggregat i mikroskopi experiment utan att behöva smälta yta bundna immunocomplexes/tau aggregat som skulle sedan att cellen åter plätering och återhämtning.
Vi har också ytterligare optimerat den mikroskopi avläsning av vår analys, jämfört med vad som tidigare varit beskrivs11, med hjälp av en mycket selektiv färga för sura organeller i våra mikroskopi experiment vilket inte gjorde att vi bara att bekräfta antikroppsmedierad Tau upptag, men också lokalisering av tau aggregat i endolysosomal facket.
Den analys som vi utvecklat, har optimal specificitet vilket resulterar i ett bra experimentella fönster som möjliggör en stark separation mellan positiva och negativa prover. Intressant är upptäcker analysen indirekt skillnader i antikropp affinitet som alltså representerar ett kraftfullt verktyg att studera anti tau antikropp effektor funktioner.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Alberto Carpinteiro Soares för hans värdefulla tekniskt bistånd.
BV-2 cells | ICLC Interlab Cell Line Collection | ATL03001 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 10010-015 | |
Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
DMEM 4.5 g/dl glucose | Gibco | 41966-029 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091-148 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
L-Glutamine 200mM | Lonza | 17-605E | |
EasYFlask | Nunc | 156499 / 159910 | |
pHrodo Green STP ester | Life Technologies | P35369 | |
Sodium Bicarbonate pH 8.5 100 mM | |||
DMSO | Sigma | D2650-100ml | |
PD10 columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
Greiner CELLSTAR multiwell culture plates | Greiner | 665180 | |
Falcon 96-Well Assay Plates | Falcon | 353910 | |
Heparin | Sigma | H3393-50KU | |
Trypsin-EDTA 0.25% | Sigma | T4049-100ml | |
BSA | Sigma | A7030-100G | |
EDTA 0.5M, pH8 | |||
FACS Canto II | BD | ||
Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
LysoTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | L12492 | |
Opera Phenix | Perkin Helmer | HH14000000 |