Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

Summary

Dieses Protokoll beschreibt einen Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie basierende Ansatz zur Untersuchung von Interaktionen zwischen den Proteinen, die Vermittlung von Zell-Zell-Interaktionen, d.h. Proteine in der Zelle Verzweigungen direkt in lebenden Zellen lokalisiert. Wir bieten detaillierte Richtlinien auf Kalibrierung, Datenerfassung und -Analyse, einschließlich Korrekturen möglich Artefakt Quellen.

Abstract

Eine Vielzahl von biologischen Prozessen umfasst Zell-Zell-Interaktionen, in der Regel vermittelt durch Proteine, die an der Schnittstelle zwischen benachbarten Zellen interagieren. Von Interesse sind nur einige Proben in der Lage, speziell solche Interaktionen direkt in lebenden Zellen zu sondieren. Hier präsentieren wir Ihnen einen Test um die Bindung der Proteine an den Oberflächen von benachbarten Zellen, Zell-Zell Kontakte zu messen. Dieser Test besteht aus zwei Schritten: Mischen von Zellen mit dem Ausdruck der Proteine des Interesses mit verschiedenen fluoreszierenden Proteinen verschmolzen, gefolgt von Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Messungen bei Zell-Zell-Kontakte mit einem konfokalen Laser-scanning-Mikroskop. Wir zeigen die Machbarkeit des Assays in einem biologisch relevanten Kontext durch die Messung der Wechselwirkungen von Amyloid Vorläufer-Like Protein 1 (APLP1) über Zell-Zell-Verbindungen. Wir bieten detaillierte Protokolle über die Datenerfassung mit Fluoreszenz-basierte Techniken (Scannen Kreuzkorrelation Fluoreszenzspektroskopie, Kreuzkorrelation Anzahl und Helligkeit Analyse) und den gewünschten Gerätes Kalibrierungen. Darüber hinaus diskutieren wir wichtige Schritte in der Datenanalyse und Gewusst wie: identifizieren und beheben Sie externe, falsche Signal Variationen, wie Sie durch Immunofluoreszenz oder Zelle Bewegung.

Im Allgemeinen der vorgestellte Test gilt für alle Homo- oder Zellkulturmodells Proteinprotein Interaktion auf Zell-Zell Kontakte zwischen den Zellen der gleichen oder unterschiedlichen Typen und kann auf eine kommerzielle konfokale Laser-scanning-Mikroskop implementiert werden. Eine wichtige Voraussetzung ist die Stabilität des Systems, das muss ausreichen, um die Sonde diffusiven Dynamik der interessierenden Proteine über mehrere Minuten.

Introduction

Viele biologische Prozesse auftreten, an den Standorten der Zell-Zell-Interaktionen, z.B. Zellezelle Adhäsion^1,2,3, Zell-Zell-Fusion-⁴ und zelluläre Anerkennung⁵. Solche Ereignisse sind besonders wichtig bei der Entwicklung von mehrzelligen Lebewesen und für die Zell-Zell-Kommunikation, z. B. während Immunantworten. Diese Prozesse werden in der Regel durch Proteine vermittelt, die an der Oberfläche, d. h. an der Plasmamembran (PM) der benachbarten Zellen lokalisiert sind und spezifische Wechselwirkungen, die auf der Zell-Zell-Kontakt genau geregelten in Raum und Zeit sind zu unterziehen. In vielen Fällen diese Interaktionen sind direkte Homo- oder Zellkulturmodells Protein-Protein- Trans -Wechselwirkungen, aber können auch beinhalten, Ionen oder Liganden als extrazelluläre linker¹. Obwohl von grundlegender Bedeutung, fehlt von Assays sondieren dieser spezifischen Protein-Protein-Interaktionen direkt in der natürlichen Umgebung von lebenden Zellen. Viele Methoden erfordern entweder Zellaufschluss (z. B. biochemische Tests wie z. B. co-Immunopräzipitation⁶), Fixierung (z. B. einige der Höchstauflösung optische Mikroskopie-Techniken und der Zell-Zell-Elektronen-Mikroskopie ⁷Kontakte), oder sind unspezifisch, z. B. Aggregation / Adhäsion assays^8,9. Um dieses Problem zu überwinden, wurden Fluoreszenztechniken umgesetzt, basierend auf Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET)¹⁰ oder Fluoreszenz Ergänzung¹¹. Um ausreichend geringe Abstände zwischen Fluorophore zu erreichen, erfordern diese Methoden jedoch Fluoreszenzmarkierungen auf der extrazellulären Seite der Proteine¹⁰, potenziell Trans Interaktionen behinderen.

Hier präsentieren wir Ihnen eine alternative Fluoreszenz basierende Assays für Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten. Dieser Ansatz verbindet Fluoreszenz Kreuzkorrelation Ansätze (Fluoreszenzspektroskopie Kreuzkorrelation Scan (sFCCS), Kreuzkorrelation Anzahl und Helligkeit (CcN & B)) und Mischen von Zellen mit dem Ausdruck einer Fusion-Konstrukt des Proteins Interesse, z. B. eine Adhäsion-Rezeptor. Die untersuchten Rezeptoren in den zwei interagierenden Zellen mit zwei spektral getrennte fluoreszierende Proteine (FPs), von der intrazellulären gekennzeichnet sind (siehe Abbildung 1A).

Die eingesetzten Methoden basieren auf der statistischen Auswertung der Fluoreszenz Schwankungen induziert durch die diffusive Bewegung von fluoreszierenden Fusionsproteinen durch die fokalen Volumen von einem konfokalen Laser-scanning-Mikroskop. Mehr im Detail Sonden der Assay die Co Diffusion der Proteine des Interesses an beiden benachbarten PMs an den Zell-Zell-Kontakten. Wenn die Proteine Trans Interaktionen durchmachen, tragen diese Trans -komplexe fluoreszierende Proteine in beiden spektralen Kanälen ausstrahlen, wodurch korrelierte Fluoreszenz Schwankungen der beiden Strahler. Auf der anderen Seite, wenn keine Bindung auftritt, werden die Nummer Schwankungen der Proteine in PMs vor, verursacht keine korrelierten Schwankungen unabhängig. Die Übernahme kann auf zwei Arten durchgeführt werden: 1) sFCCS basiert auf einer linienförmigen Scan über die Zell-Zell-Kontakt und effektiv Sonden die Interaktionen in einem Ort befindet sich im Kontaktbereich. Durch eine zeitliche Analyse der Fluoreszenz Schwankungen informiert sFCCS auch Dynamik, d. h. die Diffusionskoeffizienten von Proteinkomplexen; (2) CcN & B basiert auf eine pixelweise Analyse einer Sequenz von Bildern bei der Zell-Zell-Kontaktbereichen erworben. Es hat Fähigkeit, Sonde und Karte Interaktionen entlang der gesamten Region (in einer Bildebene) zu kontaktieren, aber liefert keine Informationen auf Dynamik. Beide Methoden sind kombinierbar mit einer Analyse der molekularen Helligkeit, d. h. die durchschnittliche Fluoreszenzsignal einzelne diffundierende Proteinkomplexe in der Zeiteinheit abgegebene und geben damit Schätzungen der Stöchiometrie von Proteinkomplexen im Zell-Zell-Kontakte.

In diesem Artikel bieten wir ausführliche Protokolle zur Probenvorbereitung, Kalibrierung, Datenerfassung und Analyse durchführen den vorgestellten Test auf eine kommerzielle konfokale Laser-scanning-Mikroskop. Die Experimente können auf jedem Instrument ausgestattet mit Photon counting oder analogen Detektoren und einem Objektiv mit hoher numerischer Apertur durchgeführt werden. Weiter wichtige Schritte des Protokolls zu diskutieren und mehrere Prozesse verursacht artifizielle Signalschwankungen, z. B. Detektor Lärm, Immunofluoreszenz oder Zelle Bewegung Korrektur Regelungen vorsehen. Entwickelt um die Wechselwirkungen zwischen adhärente Zellen Sonde, Assays für Aussetzung Zellen geändert werden kann, oder angepasst Modell Membran-Systeme, z. B. giant Unilamellar Vesikeln (GUVs) oder riesigen Plasma Membranvesikel (GPMVs), so dass die Quantifizierung von Interaktionen in verschiedenen Lipid-Umgebungen oder in Ermangelung einer organisierten Zytoskelett^12,13.

Scannen Kreuzkorrelation Fluoreszenzspektroskopie ist eine modifizierte Version der Fluoreszenz-Spektroskopie Kreuzkorrelation¹⁴ und wurde speziell für die Sonde langsam diffusiven Dynamik in Lipid-Membranen-¹⁵. Es basiert auf einer Linie Scan Akquisition senkrecht zur PM mit fluoreszierenden Proteinen von Interesse. Um Wechselwirkungen zwischen zwei unterschiedlich beschriftete Protein Arten Sonde, erfolgt die Übernahme in zwei Spektralkanäle mit zwei Laser-Linien und zwei Erkennung Fenster für die spektral getrennte Fluorophore. Durch die langsame Diffusion Dynamik von Proteinen in der PM (D≤ ~ 1 µm2/s), eine Cross-Talk-freie Messung kann durch den Wechsel der Erregung System von Linie auf¹⁵Linie durchgeführt werden. Die Analyse beginnt mit: (1) eine Ausrichtung Algorithmus Korrektur der seitlichen Zellbewegung basierend auf abschnittsweise durchschnittlich ~ 1000 Zeilen, (2) die Bestimmung der Position mit maximale Fluoreszenz-Signald.h. die Uhr Position, in jedem Block und (3) verschieben alle Blöcke bis hin zum gemeinsamen Ursprung^12,15, in jeden Kanal separat. Anschließend wird eine automatische Auswahl der Pixel entspricht der PM durchgeführt, indem der Zentralregion aus einem “glockenförmig” Anfall von der Summe aller ausgerichteten Linien (z. B. Zentrum ± 2.5σ). Integration des Signals in jeder Zeile ergibt die Membran Fluoreszenz Zeitreihen F(t) in jedem Kanal (g = Grün-Kanal, R = Rot-Kanal). Beachten Sie, dass die Pixelgröße klein genug, z. B. muss < 200 nm, die Form des Punktes zu rekonstruieren Funktion zu verbreiten und finden Sie ihre Mitte, entsprechend der Position des Premierministers. In Gegenwart von erheblichen Immunofluoreszenz Fluoreszenz Zeitreihen in jedem Kanal können mit einer Doppel-exponential-Funktion modelliert und dann mit der folgenden Formel korrigiert:¹⁶

.    (1)

Es ist wichtig zu beachten, dass diese Formel effektiv korrigiert die Amplituden und Diffusionszeiten aus der Korrelationsanalyse von F(t)^c, im Vergleich zu Parameterschätzungen, die sich aus der unkorrigierte F(t)würde. Dann das Auto und Kreuzkorrelation Funktionen (ACFs / CCFs) der Fluoreszenz Signale werden berechnet:

, (2).

, (3).

wo δF_ich = F_ich(t) – F_ich(t) und ich = g, R.

Eine zweidimensionale Diffusion Modell ist dann auf alle Korrelation Funktionen (CFs) ausgestattet:

.   (4)

Dabei bezeichnet N die Anzahl der fluoreszierende Proteine in der Beobachtung Volumen und τ_d Diffusionszeit für jeden Kanal. Dieses Modell berücksichtigt, dass in der beschriebenen experimentellen Einstellung Diffusion von Proteinen in der Uhr tritt in der X-Z-Ebene, im Gegensatz zu der häufig verwendete Konfiguration der Fluoreszenz Korrelation Spektroskopie (FCS) auf Membranen sondieren Experimente Verbreitung in der X-y-Ebene die konfokale Volumen¹⁷. Die Taille w₀ und der Struktur Faktor S, beschreibt die Dehnung von fokalen Volumen in Z, S w_Z = wZ/w₀, stammen aus einer Punkt-FCS Kalibrierung Messung mit spektral ähnliche Farbstoffe und gleichen optischen Einstellungen durchgeführt mit bereits vorhandenen Werten für den Diffusionskoeffizienten D_Farbstoff:

, (5).

wo τ_{d, Farbstoff} die gemessene durchschnittliche Verbreitung der Farbstoffmoleküle anpassen eines Modells zur dreidimensionalen Diffusion an den Daten entnommen ist Berücksichtigung Konto Übergänge von einem Bruchteil T aller N Moleküle zu einem Triplett-Zustand mit einer Zeitkonstante τ_τ:

.   (6)

Schließlich sind die Diffusionskoeffizienten (D), molekulare Helligkeitswerte (ε) und die relative Kreuzkorrelation von sFCCS Daten (rel.cc.) wie folgt berechnet:

, (7).

, (8).

, (9).

Wo befindet sich die Amplitude der Kreuzkorrelation Funktion G_überqueren(0) und ist die Amplitude der Autokorrelationsfunktion in der ich-th Kanal.

Diese Definition der relativen Kreuzkorrelation, d. h. mit max statt in der Gleichung 9 bedeuten berücksichtigt, die die maximale Anzahl von komplexen zwei Protein-Arten in unterschiedlichen Konzentrationen von begrenzt ist die in einer geringeren Anzahl vorkommenden Arten.

Kreuzkorrelation Anzahl und Helligkeit basiert auf einen Augenblick Analyse der Fluoreszenzintensität für jeden Bildpunkt ein Bildstapel erwarb im Laufe der Zeit an einer festen Position in der Probe in der Regel bestehend aus ca. 100-200 Bildern, mit zwei spektralen Kanäle () g = Grün-Kanal, R = Rot-Kanal). Aus dem zeitlichen Mittelwert ich_ich und Varianz , die molekulare Helligkeit ε_i und Nummer n_ich werden in jedem Pixel und Spektralkanal berechnet (Ich = g, R)¹⁸:

, (10).

. (11)

Es ist wichtig zu beachten, dass im Idealfall eine wahre Photon counting Detektor Formeln zuweisen. Für analoge Systeme gelten die folgenden Gleichungen^19,20:

, (12).

.   (13)

Hier, S ist der Umrechnungsfaktor zwischen erkannten Photonen und die aufgezeichneten digitalen Grafen ist das Auslesen Rauschen und Offset bezieht sich auf den Detektor Intensität Offset. Im Allgemeinen sollten diese Mengen für jeden Melder, basierend auf der Messung der Detektor Varianz als eine Funktion der Intensität für stetigen Beleuchtung¹⁹, z. B. einer reflektierenden Metalloberfläche oder getrocknete Farbstofflösung kalibriert werden. Der Versatz kann durch Messung der Pulsrate für eine Probe ohne Anregungslicht bestimmt werden. Durch die Durchführung einer linearen Regression der Detektor-assoziierten Varianz versus Intensität (ich) Grundstück, S und ermittelten¹⁹werden können:

.   (14)

Zu guter Letzt die Kreuzkorrelation Helligkeit wird in jedem Pixel berechnet und versteht man im Allgemeinen als²¹

, (15).

wo ist die Kreuz-Varianz .

Zur langlebige Schwankungen zu filtern, werden alle CcN & B Berechnungen durchgeführt nach einem Güterwagen, Filterung, unabhängig für jedes Pixel-²². Kurz, n_i, ε_ich (Ich = g, f) und B_cc in Schiebe-Segmente von z. B. 8-15 Frames berechnet. Die so erhaltenen Werte können dann gemittelt werden, um das letzte Pixel Anzahl und Helligkeit Werte zu erhalten.

Stöchiometrie-Analyse
Um die Stöchiometrie der Proteinkomplexe an den Zell-Zell-Kontakten abschätzen zu können, kann die molekulare Helligkeit separat in jedem spektralen Kanal für die sFCCS oder CcN & B Daten analysiert werden. In sFCCS erhält man einen Helligkeitswert pro Messung in jedem Kanal. In CcN & B erhält man ein Histogramm Helligkeit alle Pixel, die die Zell-Zell-Kontakt und der durchschnittliche (oder mittlere) Wert kann als repräsentative Helligkeit für die Messung verwendet werden. Durch die Ausführung der gleichen Analyse auf eine Monomere Referenz können alle Helligkeitswerte normalisiert werden, um den durchschnittlichen Oligomere Zustand der erkannten Proteinkomplexe direkt zu erhalten. An dieser Stelle ist es wichtig, auf das Vorhandensein von nicht-fluoreszierende FPs zu korrigieren, die zu einer Unterschätzung der oligomere Zustand führen kann. Dies erfolgt in der Regel durch die Messung der Helligkeit von einem Homo-dimeres Referenz Protein^23,24 mit einfarbigen sFCS oder Nummer und Helligkeit (N & B).

Protocol

1. Probenvorbereitung: Zell-Zell-mischen-Assay Hinweis: Das folgende Protokoll beschreibt den Mischvorgang für adhärente Zellen. Er kann für Zellen in Suspension kultiviert geändert werden. Samen Sie eine entsprechende Anzahl von Zellen auf einem 6-Well-Platte, z. B. 800.000 HEK 293T Zellen (mit einem Neubauer Kammer zählen gezählt), einen Tag vor Transfektion. Die Anzahl kann je nach Jahreszeit zwischen Aussaat und Transfektion geändert und bereinigt um andere Zellty…

Representative Results

Ein erster Test für die Protein-Protein-Interaktion-Assay von Zellen mit dem Ausdruck spektral unterschiedliche fluoreszierende Proteine, gefolgt von sFCCS/CcN & B Messungen (Abbildung 1), d. h. mischen durchgeführt werden auf Proteine, die nicht zu erwarten ist bei der Zell-Zell-Kontakt (d. h. eine Negativkontrolle) interagieren. Daher HEK 293T Zellen mit dem Ausdruck Myristoylated-Palmitoylated-mEYFP (Myr-Palm-mEYFP) oder -mCardinal wurd…

Discussion

Die hier beschriebene experimentelle Vorgehensweise ermöglicht die Untersuchung von Protein-Protein Trans Interaktionen bei Zell-Zell-Kontakten, Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Techniken, nämlich sFCCS und CcN & B. Diese Methoden beinhalten eine statistische Analyse der Fluoreszenz-Schwankungen, die durch zwei spektral getrennte FPs verschmolzen, benutzt von Interesse an einen Kontakt von zwei benachbarten Zellen, jeweils mit dem Ausdruck einer oder der andere Fusionsproteins emittiert. Das Vorhandensein…

Materials

DMEM growth medium	PAN-Biotech	P04-01548
DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+	PAN-Biotech	P04-36500
DPBS w: Ca2+ and Mg2+	PAN-Biotech	P04-35500
Trypsin EDTA	PAN-Biotech	P10-023100
TurboFect Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	R0531
HEK 293T cells	DSMZ	ACC 635
Alexa Fluor 488 NHS Ester	Thermo Fisher Scientific	A20000
Rhodamine B	Sigma-Alderich	83689-1G
Plasmid DNA	Addgene	NA	See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids
6-well plate	Starlab	CC7672-7506
35-mm glass bottom dishes	CellVis	D35-14-1.5-N
Zeiss LSM780 confocal	Carl Zeiss	NA
MATLAB software package	MathWorks	2015b
Neubauer cell counting chamber	Marienfeld	640110