ניתוח של Actomyosin בסולמות הסלולר והרקמה המקומית באמצעות הזמן- סרטים פקיעה של מתורבת ביצת ביצה צ'יימברס
Summary
פרוטוקול זה מספק מתודולוגיה ידידותית למשתמש המבוססת על פיג’י, יחד עם הוראות ברורות המסבירות כיצד לנתח באופן אמין את התנהגות actomyosin בתאים בודדים ורקמות אפיתל מעוקל. כישורי תיכנות אינם נדרשים לבצע את הלימוד; כל השלבים מתבצעים באופן חצי אינטראקטיבי באמצעות ממשק המשתמש הגרפי של פיג’י ותוספים משויכים.
Abstract
דרוזופילה ביצים לא בוגרות נקראות תאי ביצה, והמבנה שלהם דומה לאברים פרימיטיביים העוברים שינויים מורפולוגיים מסיבוב לצורת אליפסואיד במהלך הפיתוח. תהליך התפתחותי זה נקרא oogenesis והוא חיוני כדי לייצר ביצים בוגרות תפקודית כדי לאבטח את דור הזבוב הבא. מסיבות אלו שימשו תאי ביצה כמודל אידיאלי ורלבנטי להבנת התפתחות אברי החיות.
כמה מהפרוטוקולים בפרוטוקולים מחוץ למבחנה פותחו, אך קיימים מספר חסרונות לפרוטוקולים אלה. אחד כולל את היישום של כיסויים שונים, כי להפעיל לחץ מלאכותי על תאי ביצה התמונה כדי לשתק אותם ולהגדיל את מטוס רכישת התמונה של המשטח ההיקפי של תאי ביצה מנותח. גישה כזו עלולה להשפיע לרעה על ההתנהגות של מכונות actomyosin דק היוצר את הכוח לסובב תאי ביצה סביב הציר הארוך שלהם.
לפיכך, כדי להתגבר על מגבלה זו, אנו התרבות דרוזולה תאי ביצה באופן חופשי בתקשורת כדי לנתח בצורה אמינה מכונות actomyosin לאורך ההיקף של תאי ביצה. בחלק הראשון של הפרוטוקול, אנו מספקים מדריך המפרט כיצד לנתח את מכונות actomyosin במישור רכישה מוגבלת בקנה מידה הסלולר המקומי (עד 15 תאים). בחלק השני של הפרוטוקול, אנו מספקים למשתמשים תוסף חדש מבוסס פיג’י המאפשר החילוץ הפשוט של שכבה דקה מוגדרת של משטח הביצה ‘ היקפי. לאחר מכן, הפרוטוקול הבא מתאר כיצד לנתח אותות actomyosin בסולם הרקמה (> 50 תאים). לבסוף, אנו מאתרים את המגבלות של גישות אלה הן בסולמות הסלולר והן הרקמה המקומית ודנים בפיתוח עתידי הפוטנציאלי וביישומים אפשריים.
Introduction
פיתוח מתמשך של הדמיה הרומן וטכנולוגיות תוכנה עם יישומים במדעי החיים סיפקה השפעה עצומה על הבנת עקרונות היסוד של החיים. אחד האתגרים העיקריים הוא ההדמיה המהימנה של תהליכים התפתחותיים בשילוב עם הדמיה חיה ברקמות שונות. רקמות הן חלקים של איברים וגופים, וככאלה, הרוב אינו נגיש בקלות להדמיה. לכן, הפרוטוקולים המאפשרים את הניתוח שלהם ובדיקת החוץ הגופית פותחו על מנת להמחיש אירועים ביולוגיים המשקפים בצורה מספקת את המצב הvivo בתוך גוף חי.
במהלך העשורים האחרונים, ההדמיה החיה של מתקני ביצים של דרוזוהילה , מבנים דמוי-שכבתית הדומים לאברים פרימיטיביים, תרמה רבות להבנת העקרונות הבסיסיים של פיתוח איברים פרימיטיביים1 , מיכל השני , 3. כיום, יש כמה פרוטוקולים culturing זמין, השימוש שלהם תלוי בזמן הרכישה, סוג התא כדי להיות בתמונה, ואת הנגישות שלהם (למשל, הפנימי germline מול קו הסומאטיק החיצוני)4.
תכונה נפוצה בכל הפרוטוקולים הללו culturing הוא הצורך השתק של תאי ביצה מנותח המציגים פעילות הקונקטילה גבוהה במדיה נוזלית. הפעילות הקונאקטעית של תאי ביצה נגרמת בעיקר על ידי גיליון השריר המכסה מחרוזת ארוכה של תאי ביצה מחוברים5,6,7. לכן, כדי להשיג השתק מתאים של תאי ביצים צעירים, התפתחו גישות שונות, מעורבים כיסוי תאי ביצה עם מכסים6,8,9 או שמיכות גמיש4, 10 או להטביע אותם בנקודת התכה נמוכה-ההיתוך3,11. גישות אלה הן פופולריות כפי שהם גם מאפשרים הדמיה של מטוס חזותי גדול יותר בשל שיטוח עדין של המשטח ההיקפי של תאי הביצה.
עם זאת, לאחרונה, זה הוכח כי חדרי ביצה צעירים (שלב 1-8) לסובב סביב הציר האחורי שלהם6 וכי תנועה זו רקמה מופעל על ידי רשת actomyosin קנס קרוב למשטח ההיקפי של אלה ביצה צעירים 12. לכן, שינוי מלאכותי של משטח הסלולר הנגרם על ידי שיטוח עדין של רקמה זו עשויה להיות השפעה שלילית על התנהגות של מכונות הפקת כוח actomyosin. קונטרפונקט הוא כי אם הרקמה הקאמרית ביצה אינו משוטח, הדמיה מיקרוסקופית של חלבונים על פני השטח הcircumשל תאי ביצה הופך להיות מוגבל עוד יותר על ידי גודל ירידה של מטוס הרכישה.
לכן, יש לנו פרוטוקולים משולבים מ פראסאד ואח ‘9 ואת המעבדה של סלסט ברג4,10 ועוד שונה אותם כך לא coverslip/שמיכה גמישה/agarose משמש בשיטה מפותחת. מרבית תאי הביצה מתורבתים באופן חופשי בתקשורת והפרוטוקול המוצג כאן חל רק מיקרוסקופ הפוך. . יש שני חלקים לפרוטוקול החלק הראשון מתמקד בניתוח של אותות actomyosin בקנה מידה הסלולר המקומי (עד 15 תאים) בתוך תאי ביצה. בחלק השני אנו מתמקדים בהתגברות על המגבלות הקשורות למישור הרכישה הקטן שנגרם כתוצאה מהתפירה החופשית של תאי הביצה. בהקשר זה, פיתחנו הרומן מבוססי פיג’י שיטה חישובית עם ממשק משתמש גרפי למחצה אינטראקטיבי באופן סלקטיבי ומתגלה שכבות מוגדרות של משטח רקמות. הדבר מלווה בפרוטוקול המתאר כיצד לנתח actomyosin בסולם הרקמה (כלומר, > 50 תאים). כמו החילוץ סלקטיבי של שכבה דקה מוגדרת של רקמות אפיתל מעוקל לא ניתן בקלות באמצעות הקרנת z-מחסנית קלאסית (איור 1), זו שיטה קלה לשימוש משמש כתנאי מוקדם חשוב להבין באופן מקיף את ה אופן הפעולה של רשת actomyosin דקה (< 1 μm) בסולם הרקמה בתאי ביצת דרוסופילה .
בנוסף, כדי להקל על הפרוטוקול, אנו מספקים למשל סרטים לפקיעה זמן (TLMs) וקבצים לדוגמה של מתויג בלתי שרירים רירן II התנהגות קונבנציונאלי (ראה קובץ משלים 3). רירן II הוא חלבון מוטורי ומייצג את החלק האקטיבי של המכונות actomyosin. כדי לדמות רירן II, אנו משתמשים הקווים הטרנסגניים הכוללים שרשרת אור שונה הרגולציה של רירן II בשם mrlc:: gfp (ראה טבלת חומרים לפרטים)12,13. כדי להמחיש את קרום התאים, הפרוטוקול מבוסס על צבעים מסחריים (ראה טבלת חומרים). פרוטוקול זה מתאים לא רק לניתוח של mrlc קטן מסוג subcellular:: אותות gfp12 אבל גם עבור כל החלקיקים בגודל זהה subcellular סביב ± 300 μm, כגון אלה שנצפו עם חיים-Act:: gfp12,14.
למרות ששני הפרוטוקולים הללו מוצגים באמצעות מבחנה בתאי ביצה מחוץ לגופית, רכישת אותות actomyosin יכול גם להתבצע באמצעות רקמות אחרות על אופטימיזציה של מדיה culturing ובהתאם לזמינות של או פלואור מתויג חלבונים עם צבעים מסחריים מתאימים או, למשל, מיקרוזריקות mRNA כדי להשיג פרופילים של ביטוי גנים ארעי. באופן דומה, הפרוטוקול המבוסס על פיג’י להפקת שכבה דקה ממשטח משטח, ניתן ליישם באופן כללי יותר אליפסואיד ורקמות כמו איברים.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלבים קריטיים ופתרון בעיות לחיתוך ולניתוח של תאי ביצה
אם זבובים רבים מדי ממוקמים לתוך בקבוקון קטן, האוכל לעוף יכול להפוך מלוכלך אחרי 2 – 3 ימים בשל כמויות נרחבות של הזחלים האכלה וזבובים מבוגרים לכודים במזון לעוף. במקרה כזה, להפוך את שאר הזבובים האלה לתוך בקבוקון חדש…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים מאוד למרים אוסטררפילד על שיתוף עצתה ביצירת הדמיה של תאי ביצה באמצעות גישה שאומצה מהמעבדה של סלסט ברג4. אנחנו גם מודים לסבסטיאן טוסי על התסריט של פיג’י המאפשר פילוח של תאים.
Materials
| Schneider Medium | Gibco | 21720-024 | [+]-Glutamine |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | [+] 10.000 Units/ml Penicillin [+] 10.000 µg/ml Streptomycin |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F135 | Heat inactivated |
| Insulin Solution Human | Sigma | I9278 | |
| 50 ml Falcon tubes | Eppendorf | sterile | |
| Millex-GV filter | Millipore | SLGV033NS | 33 mm |
| Glass Bottom Microwell Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | 35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass |
| Forceps | A. Dumont & Fils | #55 | |
| CellMask Deep Red (cell membrane dye) | Invitrogen | C10046 | |
| FM4-64 (cell membrane dye) | ThermoFisher/Invitrogen | T13320 | |
| Depression dissection slide | Fisher Scientific | 12-560B | |
| Microscopic equipment | |||
| Steromicroscope | e.g. Zeiss | Stemi SV 6 | |
| Inverted confocal microscope | e.g. Zeiss/Olympus | ||
| Spinning disc microscope | e.g. Zeiss/Andor | ||
| Microscopic glass/cover glass | e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas | ||
| Cactus tool | |||
| Wironit needle holder | Hammacher | 9160020 | |
| Cactus spine | Echinocactus grusonii/barrel cactus | ||
| Drosophila stocks used in the manuscript | |||
| AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP | For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115. | ||
| AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat103C | For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107. |
Riferimenti
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3679 (2012).
- Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68, 207-217 (2014).
- Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. Cultivation and Live Imaging of Drosophila Ovaries. Methods of Molecular Biology. 1478, 215-226 (2016).
- Peters, N. C., Berg, C. A. In Vitro Culturing and Live Imaging of Drosophila Egg Chambers: A History and Adaptable Method. Methods of Molecular Biology. , 35-68 (2016).
- Spradling, A. C., Bate, M., Arias, A. M. Developmental Genetics of Oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster, Volume 1. , 1-70 (1993).
- Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331, 1071-1074 (2011).
- Andersen, D., Horne-Badovinac, S. Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila. Development. 143, 1375-1387 (2016).
- Pokrywka, N. J. Live imaging of GFP-labeled proteins in Drosophila oocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50044 (2013).
- Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).
- Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis. Biologia dello sviluppo. 267, 320-341 (2004).
- Cetera, M., et al. Epithelial rotation promotes the global alignment of contractile actin bundles during Drosophila egg chamber elongation. Nature Communications. 5, 5511 (2014).
- Viktorinova, I., Henry, I., Tomancak, P. Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLOS Genetics. 13, e1007107 (2017).
- Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling. Nature. 468, 1110-1114 (2010).
- Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Biologia dello sviluppo. 393, 209-226 (2014).
- . Surface manager Available from: https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager (2018)
- . Actomyosin dynamics: Required Software and dependencies Available from: https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins (2018)
- . BigDataViewer Available from: https://imagej.net/BigDataViewer (2017)
- Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
- Turner, C. M., Adler, P. N. Distinct roles for the actin and microtubule cytoskeletons in the morphogenesis of epidermal hairs during wing development in Drosophila. Mechanisms of Development. 70, 181-192 (1998).
- Heemskerk, I., Streichan, S. J. Tissue cartography: compressing bio-image data by dimensional reduction. Nature Methods. 12, 1139-1142 (2015).
- Chen, D. Y., Lipari, K. R., Dehghan, Y., Streichan, S. J., Bilder, D. Symmetry Breaking in an Edgeless Epithelium by Fat2-Regulated Microtubule Polarity. Cell Reports. 15, 1125-1133 (2016).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).
