使用培养的果蝇卵室延时电影对局部细胞和组织尺度的actomyosin动力学的分析
Summary
该协议提供了一种基于斐济的、用户友好的方法,以及解释如何可靠地分析单个细胞和弯曲上皮组织中的actomyosin行为的直截了当的说明。无需编程技能即可遵循本教程;所有步骤均使用斐济的图形用户界面和相关插件以半交互式方式执行。
Abstract
果蝇未成熟卵被称为卵室,其结构类似于原始器官,在发育过程中从圆形到椭圆形形态发生形态变化。这种发育过程被称为”成因”,对于生成功能成熟卵子以确保下一代苍蝇至关重要。由于这些原因,卵室已成为了解动物器官发育的理想和相关模型。
已经开发了几种体外培养方案,但这些协议有几个缺点。其一涉及应用各种盖,对图像蛋室施加人工压力,以固定它们,并增加被分析的蛋室圆周表面的图像采集平面。这种方法可能会对产生围绕其长轴旋转蛋室的功率的薄肌苷机械的行为产生负面影响。
因此,为了克服这一限制,我们在介质中自由培养果蝇卵室,以便可靠地分析沿着蛋室周长的actomyosin机械。在协议的第一部分,我们提供了一份手册,详细介绍了如何在局部细胞规模(最多15个细胞)的有限采集平面中分析actomyosin机械。在协议的第二部分,我们为用户提供了一个新的基于斐济的插件,允许简单地提取蛋室圆周表面的一个定义的薄层。然后,以下协议描述了如何在组织尺度(>50细胞)分析肌苷信号。最后,我们指出这些方法在局部细胞和组织尺度上的局限性,并讨论其潜在的未来发展和可能的应用。
Introduction
新型成像和软件技术在生命科学中的应用不断发展,对理解生命的基本原则产生了巨大影响。主要挑战之一是动态发育过程的可靠可视化,以及不同组织中的实时成像。组织是器官和身体的一部分,因此,大多数不容易获得成像。因此,已经制定了允许其解剖和体外培养的协议,以便可视化生物事件,充分反映活体内的体内状况。
在过去的几十年里,果蝇卵室的培养和活成像,类似原始器官的类似类似类似动物的结构,极大地促进了对原始器官发育基本原则的理解1。,2,3.目前,有几种培养协议可用,其使用取决于采集时间、要成像的细胞类型及其可访问性(例如,内生殖系与外体线)4 。
所有这些培养协议中的一个共同特征是需要固定分析的蛋室,这些卵室在液体介质中表现出高收缩活性。卵室的收缩活动主要是由覆盖着一长串连接的卵室5、6、7的肌肉表引起的。因此,为了适当固定幼蛋室,已开发出各种方法,包括用盖片覆盖蛋室6、8、9或柔性毛毯4, 10或嵌入低熔点甘蔗3,11。这些方法很受欢迎,因为它们还允许对更大的视觉平面进行成像,因为蛋室的圆周表面很细平。
然而,最近,已经表明,年轻的卵室(阶段1-8)围绕其前后轴6旋转,并且这种组织运动是由接近这些年轻卵室圆周表面的精细肌苷网络供电的12.因此,由这种组织细微扁平引起的细胞表面的人工改变可能对产生力的肌苷机械的行为产生负面影响。相反,如果卵室组织不扁平,卵室圆周表面的蛋白质显微成像将因采集平面尺寸减小而变得更加有限。
因此,我们结合Prasad等人9和Celeste Berg 4、10实验室的协议,进一步修改它们,以便在开发的方法中不使用盖玻片/柔性毯子/agarose。果蝇卵室在介质中自由培养,此处介绍的协议仅适用于倒置显微镜。该协议分为两个部分。第一部分侧重于分析在卵室内局部细胞规模(多达15个细胞)的actomyosin信号。在第二部分,我们专注于克服与卵子室自由培养引起的小采集平面相关的限制。在这方面,我们开发了一种基于斐济的新型计算方法,采用半交互式图形用户界面,选择性地提取和展开圆周组织表面的已定义层。之后是一个协议,描述如何在组织规模(即>50细胞)分析肌苷。由于使用经典 z 堆栈投影(图 1)选择性地提取已定义的曲面上皮组织的薄层(图1),这种易于使用的方法是全面了解在果蝇卵室的组织尺度上,一个薄(<1μm)的肌苷网络的行为。
此外,为了方便该协议,我们提供示例延时电影(TlMs)和荧光标记的非肌肉常规肌苷II行为的样本文件(见补充文件3)。肌苷II是一种运动蛋白,代表肌酸机械的活性收缩部分。为了成像肌辛II,我们使用果蝇转基因线,其中包含一个经过修饰的肌素II的调节光链,称为MRLC::GFP(详见材料表)12,13。为了可视化细胞膜,该协议基于商业染料(见材料表)。该协议不仅适用于分析小亚细胞MRLC::GFP信号12,也适用于±300μM周围的任何类似大小的亚细胞粒子,如使用生命行动::GFP 12、14观测到的亚细胞粒子。
虽然这两种协议都使用体外培养的果蝇卵室呈现,但在优化培养培养培养和取决于可用性时,也可以使用其他组织进行actomyosin信号的采集荧光标记的蛋白质与相应的商业染料,或,例如,mRNA显微注射,以获得瞬态基因表达配置文件。同样,从圆周表面提取薄层的斐济协议可以更普遍地应用于椭圆体和类似器官的组织中。
Protocol
Representative Results
Discussion
蛋室解剖和培养的关键步骤和故障排除
如果太多的苍蝇被放入一个小瓶中,由于大量喂食幼虫和成年苍蝇被困在苍蝇食物中,苍蝇食物在2~3天后会变浑浊。在这种情况下,将这些苍蝇剩下的放入一个新的小瓶中,加入新鲜食物,并缩小它们的数量。特别是,排除被困在食物中的女性。
施耐德混合物(SM)应提前准备,可在4°C下储存14天。请注意,较旧的混?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者非常感谢米里亚姆·奥斯特菲尔德使用塞莱斯特·伯格实验室4采用的方法分享她对卵子室体外生命成像的建议。我们还感谢塞巴斯蒂安·托西的斐济脚本,使细胞分割。
Materials
| Schneider Medium | Gibco | 21720-024 | [+]-Glutamine |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | [+] 10.000 Units/ml Penicillin [+] 10.000 µg/ml Streptomycin |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F135 | Heat inactivated |
| Insulin Solution Human | Sigma | I9278 | |
| 50 ml Falcon tubes | Eppendorf | sterile | |
| Millex-GV filter | Millipore | SLGV033NS | 33 mm |
| Glass Bottom Microwell Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | 35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass |
| Forceps | A. Dumont & Fils | #55 | |
| CellMask Deep Red (cell membrane dye) | Invitrogen | C10046 | |
| FM4-64 (cell membrane dye) | ThermoFisher/Invitrogen | T13320 | |
| Depression dissection slide | Fisher Scientific | 12-560B | |
| Microscopic equipment | |||
| Steromicroscope | e.g. Zeiss | Stemi SV 6 | |
| Inverted confocal microscope | e.g. Zeiss/Olympus | ||
| Spinning disc microscope | e.g. Zeiss/Andor | ||
| Microscopic glass/cover glass | e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas | ||
| Cactus tool | |||
| Wironit needle holder | Hammacher | 9160020 | |
| Cactus spine | Echinocactus grusonii/barrel cactus | ||
| Drosophila stocks used in the manuscript | |||
| AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP | For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115. | ||
| AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat103C | For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107. |
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