Questo protocollo fornisce una metodologia fiji-friendly insieme a semplici istruzioni che spiegano come analizzare in modo affidabile il comportamento dell'actomyosina nelle singole cellule e nei tessuti epiteliali curvi. Non sono richieste competenze di programmazione per seguire il tutorial; tutti i passaggi vengono eseguiti in modo semi-interattivo utilizzando l'interfaccia utente grafica delle Fiji e dei plugin associati.
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Articolo metodologico
Analisi delle dinamiche di Actomyosin su scale cellulari e tissutali locali utilizzando film time-lapse di camere d'uovo di Drosophila coltivate
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le uova immature della Drosophila sono chiamate camere d'uovo, e la loro struttura assomiglia agli organi primitivi che subiscono cambiamenti morfologici da una forma rotonda a una ellissoide durante lo sviluppo. Questo processo di sviluppo è chiamato oogenesi ed è fondamentale per generare uova mature funzionali per garantire la prossima generazione di mosche. Per questi motivi, le camere d'uovo sono servite come modello ideale e pertinente per comprendere lo sviluppo di organi animali.
Sono stati sviluppati diversi protocolli di coltura in vitro, ma questi protocolli presentano diversi svantaggi. Uno comporta l'applicazione di varie coperture che esercitano una pressione artificiale sulle camere d'uovo foto al fine di immobilizzarle e per aumentare il piano di acquisizione immaginato della superficie circonferenziale delle camere d'uovo analizzate. Tale approccio può influenzare negativamente il comportamento del sottile macchinario di actomiosina che genera il potere di ruotare le camere d'uovo intorno al loro asse più lungo.
Così, per superare questa limitazione, noi cultura Camere d'uovo Drosophila liberamente nei media al fine di analizzare in modo affidabile macchinari di actomyosina lungo la circonferenza delle camere d'uovo. Nella prima parte del protocollo, forniamo un dettaglio manuale su come analizzare il macchinario actomyosina in un piano di acquisizione limitato su scala cellulare locale (fino a 15 celle). Nella seconda parte del protocollo, forniamo agli utenti un nuovo plugin basato sulle Fiji che consente la semplice estrazione di uno strato sottile definito della superficie circonferenzale delle camere d'uovo. Il seguente protocollo descrive quindi come analizzare i segnali di actomiosina su scala tissutale (>50 cellule). Infine, abbiamo individuato i limiti di questi approcci sia per la rete cellulare locale che per i tessuti e discutiamo del suo potenziale sviluppo futuro e delle possibili applicazioni.
Introduzione
Il continuo sviluppo di nuove tecnologie di imaging e software con applicazioni nelle scienze della vita ha fornito un enorme impatto sulla comprensione dei principi di base della vita. Una delle sfide principali è la visualizzazione affidabile dei processi di sviluppo in combinazione con la loro imaging dal vivo in vari tessuti. I tessuti sono parti di organi e corpi e, in quanto tali, la maggior parte non sono facilmente accessibili per l'imaging. Pertanto, sono stati sviluppati protocolli che consentono la loro dissezione e la loro coltura in vitro al fine di visualizzare eventi biologici che riflettono sufficientemente la situazione in vivo all'interno di un corpo....
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Protocollo
NOT: Il seguente protocollo fornisce istruzioni su come analizzare l'actomiosina al cellulare locale e la scala del tessuto nelle camere d'uovo della Drosophila. L'approccio su scala locale consente agli utenti di analizzare il comportamento dettagliato della actomiosina in un massimo di 15 celle per camera d'uovo e richiede l'acquisizione di TLM per un breve periodo di tempo (5-10 min) utilizzando immagini ad alta velocità e un microscopio confocale invertito. Al contrario, la scala tissutale fornisce agli utenti informazioni sulla actomiosina in 50-100 cellule e richiede l'acquisizione di TLM per un lungo periodo di tempo (30 min) utilizzand....
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Risultati
Questo protocollo consente agli scienziati di studiare il comportamento delle reti di actomyosina nei tessuti epiteliali. Ciò è possibile solo quando un'analisi dettagliata del comportamento dell'actomiosina su scala cellulare locale (alcune cellule) è combinata con un'analisi simile su scala tissutale (molte cellule). Tuttavia, i tessuti epiteliali sono spesso curvi e l'estrazione di uno strato sottile di questi tessuti in precedenza non era facilmente possibile, come mostrato nelle came.......
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Discussione
Passaggi critici e risoluzione dei problemi per la dissezione e la coltura delle camere d'uovo
Se troppe mosche vengono poste in una piccola fiala, il cibo a mosca può diventare fangoso dopo 2-3 giorni a causa di ampie quantità di larve di alimentazione e mosche adulte intrappolate nel cibo a mosca. In tal caso, capovolgere il resto di queste mosche in una nuova fiala con cibo fresco e ridimensionare il loro numero. In particolare, escludere le femmine che erano bloccate nel c.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori sono molto grati a Miriam Osterfield per aver condiviso i suoi consigli sull'imaging in vitro delle camere d'uovo utilizzando un approccio adottato dal laboratorio Celeste Berg4 . Ringraziamo anche Sebastian Tosi per lo script Fiji che consente la segmentazione cellulare.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Schneider Medium | Gibco | 21720-024 | [+]-Glutammina |
| Penicillina/Streptomicina | Gibco | 15140-122 | [ +] 10.000 Unità/mL Penicillina [+] 10.000 µ g/mL Streptomicina |
| Fetale Siero Bovino Sigma | F135 | inattivata a caldo | |
| Sigma umano | I9278 | ||
| Provette Falcon da 50 mL | Filtro | sterile | |
| Millipore | SLGV033NS | Piastre | |
| per micropozzetti con fondo in vetro | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Piastra Petri da 35 mm, Microwell da 14 mm, vetro di copertura n. 1.5 |
| Pinze | A. Dumont & Fils | #55 | |
| CellMask Deep Red (colorante per membrana cellulare) | Invitrogen | C10046 | |
| FM4-64 (colorante per membrana cellulare) | ThermoFisher/Invitrogen | T13320 | |
| Vetrino per dissezione a depressione | Fisher Scientific | 12-560B | |
| Microscopic equipment | |||
| Steromicroscope | ad es. Zeiss | Stemi SV 6 | |
| Microscopio confocale invertito | , ad es. Zeiss/Olympus | ||
| Microscopio a disco rotante | ad es. Zeiss/Andor | ||
| Microscopic glass/cover glass | , ad es. Thermo Scientific/Menzel Glas | ||
| Cactus tool | |||
| Wironit needle holder | Hammacher | 9160020 | |
| Cactus spine | Echinocactus grusonii/barrel cactus | ||
| Drosophila ceppi utilizzati nel manoscritto | |||
| AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP | Per i dettagli si veda Rauzi et al.: I flussi contrattili planari polarizzati di actomiosina controllano il rimodellamento della giunzione epiteliale. Natura 2010, vol. 468, pp. 1110-1115. | ||
| AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat2103C | Per i dettagli vedi Viktorinova et al.: La rotazione epiteliale è preceduta dalla rottura della simmetria planare dell'actomiosina e protegge il tessuto epiteliale dalle deformazioni cellulari. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Numero 11, pag. e1007107. |
Riferimenti
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3679(2012).
- Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68, 207-217 (2014).
- Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S.....
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Ristampe e permessi
