여기에 설명 된 프로토콜 설명 면역 형광 분석, biocytin 복구 hippocampal CA2 수는 세포내 electrophysiological 녹음 생체 외에서, 수 있도록 신경 다음의 높은-품질 개조 특성화 고 궁극적으로 훌륭한 신경 해부학 공부를 해야.
어떻게 처리 하는 대뇌 피 질의 네트워크 활동 정보는 기본 및 임상 과학 질문의 다 수 중요 합니다. 여기에 설명 된 프로토콜이이 회로의 기본 구성 요소를 식별 합니다. 대뇌 피 질 영역의 심층 연구 회로 구성 요소와 다른 과학자 들은 두뇌 획득 하는 방법에 대 한 이해에 필요한, 처리 하 고 정보 및 어떤 질병은 electrophysiological 동안에 잘못 되 면 저장 제공 궁극적으로 것 이다 그리고 형태학 상 데이터 계산 신경 네트워크 모델을 찾아보기 정보 처리의 건설에 의해 널리 사용 됩니다. 여기에 설명 된 프로토콜에 설명 합니다 어떻게 해 마 CA2 영역에 기록 biocytin 가득 세포를 복구 하 여 다음 3d에서 재구성. 또한, 프로토콜 칼슘 의무적인 단백질 또는 펩 티 드 콘텐츠 기록된 수의 데모를 설명합니다.
피 질과 해 마는 이러한 복잡성을 신경의 분류 하위1,2,3,4, 그들 사이 연결의 지도5,6 의 구조 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 고이 회로 인지 기능12,13,,1415 를 지원 하는 방법을 아직도 강렬한 연구와 지속적인 토론의 주제 아래 있습니다. 예를 들어 세부 사항 및 회로의 복잡성을 이해 하 고 많은 다른 연구에서 얻은 데이터를 조정 그것 정의 하 고 구성 요소, 설명 수 친절 하지만 어떻게 논쟁에 대 한 문제에 남아 있다 다른 많은 클래스의 존재, 또는 특정 클래스에 속한 모든 신경 세포를 정의 가능 여부입니다. 전산 도구를 구축 하 고 복잡 다양 한 각도와 회로 테스트할 수 있습니다 개발된16,,1718, 하지만 이러한 노력에 중앙은 셀 유형의 상세한 연구에 대 한 필요성 그리고 그들 사이 연결의 속성. 많은 양의 성인 쥐의 피 질 지역 회로 대 한 정보는 이미 수집 된를 사용 하 여 프로토콜 설명 여기10,,1920,21, 22. “배선 다이어그램” 완전 한에서 멀리 이다, 일부 취소 패턴 또는 규칙 등장. 또한, 일부 내용은 다르지만, 이러한 규칙은 일반적인 두 포유류 종 (쥐와 고양이)와 여러 neocortical 지역에 걸쳐 인간의 피 질에 동등 하 게 적용 될 가능성이 기본 빌딩 블록의 개발을 허용. 여기에 설명 된 기술은 식별 연 접 및 postsynaptic 신경 영역을 공부 하지 않은 전에, 자세하게는 프로토콜을 사용 하 여 연결에 참여 하 여 대뇌 피 질의 회로의 기능 지도 대 한 우리의 이해를 확장 하는 데 사용 됩니다. 그 성인 뇌 조직에 우수한 조직 보존 및 놀라운 얼룩 복구 수 있습니다. CA2에 로컬 회로 및이 하위 필드 연결 속성에는 데이터, biocytin 세포내 electrophysiological 녹음 (쌍된 녹음 날카로운 microelectrodes와) 결합 하 여이 방법으로 수집 된 면역 형광 검사, 조직학 절차 및 매우 상세한 신경 개조, 이웃 캘리포니아 지역23,,2425와 직접 비교를 허용.
이 문서에서 설명 하는 기술은 자세한 신경 해부학 세포와 높은 품질의 정확한 분류와 둘 다 그들의 수지상 및 axonal 아 버, 될 수 있는 데이터의 정확한 개조를 수 년에 걸쳐 개발 되었습니다. 날카로운 전극을 사용 하 여 쌍을 이루는 녹음에서 수집한 electrophysiological 데이터와 상관 된다. 조직학 프로토콜은 보존 하는 뉴런의 열 대권 외 고 얻을 수지상 (등 쪽이) 및 axonal 버는 우수한 복구 최적화 되었습니다. 예를 들어 통 솔루션에 immersing 첫째와 둘째 오스뮴 tetroxide에 고정 후 이중 고정 기술의 원리는 가벼운 현미경 검사 법26좋은 대조를 제공 합니다. 글 고 picric 산 솔루션의 소량 항 체 침투를 강화 하 고 세포의 열 대권 외의 이전 연구27에 제안으로 보존 하 통 솔루션에 추가 됩니다. 전통적인 세제 보다는 자당, cryo-보호와 함께 동결-해 동 방법을 사용 하 여 뇌 조각의 permeabilization 또한 기록 된 셀의 자세한 형태소 분석에 대 한 조직의 최적의 보존을 제공 합니다. 또한, 특히 매우 미세 구조의 시각화는 배경, 과산화 수소 (H2O2)와 나트륨 borohydride (NaBH4) 외피와 착 색을 줄임으로써 향상 됩니다. 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)를 니켈 염화 물 (NiCl2)를 추가 검은 색소 반응 제품을 얻기 위해 반응 또한 대비를 높입니다.
다음 프로토콜 우수한 조직 보존 및 매우 상세한 신경 3D 복원 생체 외에서세포내 기록을 확인 하는 데 사용 하는 절차를 설명 합니다. 조각 준비 설명 사용 하 여 세포내 짝된 녹음 날카로운 전극 그리고 우리의 실험실에서 사용 되는 후속 조직학 절차 이전에 보고 된28. 450-500 μ m 두꺼운 조각에서 biocytin 침 가득 셀에 적용 되는 프로토콜, 비록 동일한 프로토콜 전체 세포 기록에 따라 사용할 수 있습니다. 그러나, 얇은 슬라이스를 사용 하 여 셀의 덜 완전 한 복원 발생 합니다.
Electrophysiological 녹음에서 생체 외에서 (그림 1 Ac,d 및 Bc, d) 조직화 학적인 결합 및 immunohistochemical 절차 세부 형태, 칼슘 바인딩 단백질 콘텐츠를 사용 및 성숙한 대뇌 피 질의 수의 정체성 밝혀 기록. CA2 영역에서이 기술을 처음으로 지역 회로의 연구 허용 한 CA1 또는 CA3에서 이전에 설명 하지 않는 했다 수의 서브 클래스 공개: 넓은 수지상 및 axonal 아 버 바구니 세포 (그림 1B), bistratified 세포와 SP SR 수입니다.
여기에 설명 된 프로토콜은 보존 하는 뉴런의 열 대권 외 고 얻을 수지상 (등 쪽이) 및 axonal 버는 우수한 복구 최적화 되었습니다. 중요 한 단계 가벼운 현미경 검사 법26 대비 향상을 이중 고정 기술의 사용 등도 picric 산 솔루션 항 체 침투를 강화 하 고는 신경 보존을 통 솔루션을 추가 열 대권 외의27 부드러운 동결-해 동 permeabilization osmication 및 수 지 포함 z-비행기 수축28을 줄일 수 있지만 미세 구조의 더 나은 보존을 제공 합니다. 또한, 매우 미세 구조 (예를 들어 작은 boutons와 축 삭 괜 찮)의 시각화 잠복기 섹션 H2O2 와 NaBH4 배경 얼룩을 줄이기 위해 향상 됩니다. 대비는 HRP 반응에 NiCl2 의 추가 함께 또한 증가 수 있습니다.
여기서 설명 하는 조직학 절차 재현성 및 신뢰성 측면에서 우수한 결과 제공 합니다. 그러나, electrophysiological 녹음 기간 biocytin/형광 얼룩, 가난한 axonal 얼룩과 일반적으로 관련 된 짧은 녹음의 품질을 결정 합니다. 프로토콜 (사용 하 여 전체 셀 패치 클램핑 대 날카로운 전극 세포내 녹음) 녹음의 선택 또한 biocytin 보존 및 미세 해부학의 보존에 영향을 미칠 수 있습니다.
어려움에 발생 하는 동안 감사는 여기에 설명 된 조직학 처리 및 100 배 확대 (축 삭의 복잡도 따라 1-4 주간)에서 재구성 하는 데 걸린 시간 동안 미세 구조를 보존, 제공 하는이 메서드는 돌기 및 axonal 직경의 정확한 표현입니다. 그러나 적은 biocytin 라벨을 요구 하는 프로토콜의 사용은 이해할 수 있다,, 이들은 종종 훌륭한 axonal 분기의 명확한 시각화 배제. 세제, Avidin-HRP biocytin 및 항 체, 공개 항목을 홍보 하는 종종 두꺼운 부분에 필요 하지만 미세 구조를 혼란 시킬 수 있다. 신경 검색 지속적으로 반자동 방식의 재건, 하지만, 지금은 하 고 수동 재구성으로 특히, biocytin HRP axons 금31남아 있습니다.
매우 상세한 신경 개조, 특히 정확한 도면 axonal boutons 및 노드, 존재 또는 부재 myelin의와 더 일반적으로 정확한 축 삭 직경의 표현으로 완전 한 axonal 아 버의 그림을 따라 변경의 길이, interneurone의 다른 종류의 정확한 식별에 대 한 정보를 추가 제공. 위에서 설명한 기술을 신경 electrophysiological 속성, 및 연결의 특정 종류와 관련 된 상세한 단기적인가 소성에 상호 관련 된 데이터를 제공 합니다 많은 수는 특정 클래스에 정확히 맞지 않을 수도 있습니다, 비록 신경 개조, 배선 다이어그램, CA2 영역, 예를 들어 자세히 공부 수 있도록
정밀한, 상세한 구조는 종종 전산 모델 간소화 됩니다. 반면, 미래에 중요 한 증명할 수 있는 정보의 손실 발생 합니다. 병렬 시 냅 스 데이터와 상세한 3D 복원의 분석 조건의 더 interneuronal 분류에 대 한 추가 수 있습니다. 데이터 공개 저장소에 고 modellers 계산 축 삭 직경 및 myelination 활동 전위 전파에 산발적 변경의 결과 탐구 하는 데 사용 될 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 노바 티 스 제약 (바젤) 및 의료 연구 위원회 교수 알렉스 톰슨, 생명 공학 및 생물 과학 연구 위원회 (BBSRC-BB/G008639/1), 생리 적인 사회, 유럽 연합의 수 여에서 자금 받았다 수평선 2020 프레임 워크 프로그램 연구 및 혁신 특정 부여 계약 번호 720270에서 (인간의 두뇌 프로젝트 SGA1)에 대 한 특정 권한 부여 계약 번호 785907에서 (인간의 두뇌 프로젝트 SGA2). 우리는 매우 감사 교수 알렉스 톰슨에 자금 확보, 다른 대뇌 피 질의 영역에 프로토콜을 설정 하 고 그녀의 지속적인 지원을 위해이 프로젝트에 대 한. 연구소-회원 복구 프로토콜을 최적화 하는 데 도움이 및 CA2 뉴런을 재건 기여는 인정 하 고 기꺼이: J. Deuchars, H. Pawelzik, D. I. 휴즈, A. P. 베 니, K. Eastlake, H. Trigg, N. A. Botcher.
Avidin-7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid (Avidin-AMCA) antibody- 20.8 mg/mL | Vector laboratories | A2008 | |
Biocytin ≥98% (TLC) | Sigma | B4261 | |
3,5 diaminobenzidine (DAB) tablet, To prepare 5 mL | Sigma | D4293 | |
Durcupan epoxy resin A | Sigma | 44611 | |
Durcupan epoxy resin B | Sigma | 44612 | |
Durcupan epoxy resin C | Sigma | 44613 | |
Durcupan epoxy resin D | Sigma | 44614 | |
Ethanol, puriss. p.a., absolute, ≥99.8% | Sigma | 32221 | |
Gelatin | Sigma | 48723 | |
Glutaraldehyde solution, grade I, 25 % in H2O | Sigma | G5882 | |
Glycerol, ≥99% | Sigma | G5516 | |
Goat serum | Sigma | G9023 | |
Goat anti-mouse fluorescein isothiocyanate (FITC)- 14.3 mg/mL | Sigma | F2653 | |
Goat anti-rabbit Texas Red (TR)- 3.3 mg/mL | Invitrogen | T2767 | |
Hydrogen peroxide, 30% solution | Sigma | H-1009 | |
Immersion oil, viscosity 1.250 cSt (lit.) | Sigma | I0890 | |
Nickel chloride (NiCl2 . 6H2O) | Sigma | N5756 | |
Osmium tetroxide, for electron microscopy, 4% in H2O | Sigma | 75632 | |
Paraformaldehyde, reagent grade, crystalline | Sigma | P6148 | |
Picric acid, moistened with water, ≥98% | Sigma | 197378 | |
Phosphate buffer 1 M | Sigma | P3619 | |
Propylene oxide (C3H6O), 99% | Alfa Aesar | 30765 | |
Sodium tetrahydroborate | VWR | 27885.134 | |
Sucrose | Fisher scientific | S/8600/53 | |
Trizma Hydrochloride, ≥99.0% | Sigma | T5941 | |
Trizma base, ≥99.9% | Sigma | T6066 | |
Vectashield Antifade Mounting Medium, , refractive index 1.45 | Vector laboratories | H-1000 | |
Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector laboratories | PK6100 | |
Equipment used | |||
Vibratome | Agar Scientific | ||
C4A Cupped aluminium planchettes | GA-MA & ASSOCIATES, INC. | ||
Leica DMR microscope | Leica Microsystems | ||
X-Cite 120PC Q fluorescence light source | Excelitas Technologies | ||
Leica DFC450 digital microscope camera | Leica Microsystems | ||
Rapidograph technical drawing pen 0.18mm | London graphics centre | ||
0.18mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
Rapidograph technical drawing pen 0.25mm | London graphics centre | ||
0.25mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
Neurolucida system including PC workstation, stage, camera and joystic for XYZ stage control | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
Neurolucida software version 2017 | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
CorelDRAW graphics Suite X5 | Corel | ||
Video editing software | Adobe Premiere Pro | ||
Glass vials 14 mL | Fisher scientific |