Protokollen skissert her beskriver immunofluorescence analyse, biocytin utvinning og høy kvalitet rekonstruksjoner av hippocampus CA2 interneurons etter intracellulær elektrofysiologiske opptak i vitro, slik neuronal karakterisering og til slutt fine neuronal anatomi studier.
Hvordan kortikale nettverksaktivitet behandler er informasjon viktig for et stort antall grunnleggende og klinisk faglige spørsmål. Protokollen beskrevet her identifiserer de grunnleggende byggesteinene av denne kretsene. De grundige studiene av kortikale områder vil til slutt gi andre forskere krets komponenter nødvendig for en forståelse av hvordan hjernen kjøper, behandles og lagres informasjon og hva som går galt i sykdom, mens den elektrofysiologiske og morfologiske data brukes av beregningsorientert neuroscientists i byggingen av modellen nettverk som utforske informasjonsbehandling. Protokollen skissert her beskriver hvordan biocytin-fylte celler i området CA2 hippocampus gjenopprettes og deretter rekonstruert i 3D. I tillegg beskriver protokollen demonstrasjon av kalsium bindende protein eller peptid innhold i registrert interneurons.
Cortex og hippocampus er strukturer av slike kompleksitet at klassifiseringen av neuronal subtyper1,2,3,4, kart over forbindelsen mellom dem5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 og hvordan denne krets støtter kognitive funksjoner12,13,14,15 er fortsatt under intens studier og fortsetter stridsspørsmål. For eksempel forstå detaljene og kompleksiteten av kretsene og koordinere data fra mange forskjellige studier, det er svært nyttig å definere og beskrive komponentene, men det er fortsatt en sak for debatt hvor mange forskjellige klasser av neurons finnes, eller selv om det er mulig å definere alle neurons som tilhører en bestemt klasse. Beregningsorientert verktøy som kan bygge og teste kretser med varierende grad av kompleksitet blir utviklet16,17,18, men sentralt i disse forsøkene er behov for detaljerte studier av cellen og egenskapene for forbindelsen mellom dem. En stor mengde informasjon om den lokale krets av neocortex av voksen rotter har allerede samlet ved hjelp av protokollen beskrevet her10,19,20,21, 22. selv om “koblingsskjemaet” er langt fra fullstendig, noen fjerner mønstre eller regler har kommet. Videre, selv om noen detaljer variere, disse reglene er felles til to pattedyrarter (rat og katten) og over flere neocortical regioner, slik at utviklingen av grunnleggende byggesteinene som trolig vil bli like gjeldende for menneskelig neocortex. Teknikken beskrevet her brukes til å utvide vår forståelse av funksjonelle kart over kortikale krets ved å identifisere presynaptic og postsynaptic neurons involvert i tilkoblinger i regionene som ikke har vært undersøkt i detalj før, bruker en protokoll som gir utmerket vev bevaring og bemerkelsesverdig flekker frisk i voksen hjernevev. Data på den lokale krets i ca 2 og neuronal egenskaper i dette underfeltet er samlet med denne metoden ved å kombinere intracellulær elektrofysiologiske opptak (sammenkoblede opptak med skarpe microelectrodes) med biocytin fyller, immunofluorescence, histologiske prosedyrer og svært detaljerte neuronal rekonstruksjoner, tillater direkte sammenligning med de nærliggende CA regioner23,24,25.
Teknikken er beskrevet i denne artikkelen har blitt utviklet gjennom årene for å få detaljert neuronal anatomi slik at riktig klassifisering av celler og høy kvalitet og nøyaktig rekonstruksjoner av både deres dendrittiske og axonal arbors, kan data som kan være korrelert med elektrofysiologiske data samlet inn fra sammenkoblede innspillinger med skarpe elektroder. Histologiske protokollen er optimalisert for å bevare ultrastructure av neurons og få utmerket utvinning av både dendrittiske (inkludert spines) og axonal arbors. For eksempel gir prinsippet om dobbel fiksering teknikken av først leve i en etappe, den stabiliserende løsning og andre post fikse i osmium tetroxide god kontrast * lys26. En liten mengde glutaraldehyde og pikrinsyre løsning legges til etappe, den stabiliserende løsningen å forbedre antistoff gjennomtrenging og bevare cellenes ultrastructure som foreslått i en tidligere studie27. Permeabilization hjernen sektorene med metoden fryse-Tin kombinert med cryo-beskyttelse med sukrose, snarere enn en tradisjonell vaskemiddel, gir optimal bevaring av vev for detaljert morfologisk analyse av innspilte cellene. I tillegg er visualisering spesielt av veldig fine strukturer forbedret ved å redusere bakgrunnen flekker, med incubations med hydrogenperoksid (H2O2) og natrium borohydride (NaBH4). Legge nikkel-klorid (NiCl2) til pepperrotperoksidase (HRP) øker reaksjon å få et svart pigment reaksjon produkt også kontrasten.
Følgende protokollen beskriver prosedyrene vil avgjøre utmerket vev bevaring og svært detaljerte neuronal 3D rekonstruksjoner intracellulær opptak i vitro. Beskrivelsen av skive preparatet, intracellulær sammenkoblede innspillinger med skarpe elektroder og påfølgende histologiske prosedyrer brukes i vårt laboratorium har vært tidligere rapporterte28. Selv om protokollen gjelder for cellene fylt intracellulært med biocytin i 450-500 μm tykke skiver, kan den samme protokollen brukes etter hele celler innspillinger. Men vil bruk av tynnere skiver resultere i mindre komplett rekonstruksjoner av cellene.
Elektrofysiologiske recordings i vitro (figur 1 Ac,d og F.Kr., d) kombinert med histochemical og immunohistochemical prosedyrer aktiverer detaljert morfologi, kalsium bindende proteininnhold og identiteten til voksen kortikale interneurons registrert å bli avslørt. I regionen CA2, denne teknikken tillatt studiet av den lokale krets for første gang og avslørte underklasser av interneurons som ikke hadde vært tidligere beskrevet i CA1 eller CA3: bred dendrittiske og axonal arbor kurv celler (figur 1B), lagdelte celler og SP-SR interneurons.
Protokollen beskrevet her er optimalisert for å bevare ultrastructure av neurons og få utmerket utvinning av både dendrittiske (inkludert spines) og axonal arbors. Avgjørende skritt inkluderer bruk av dobbel fiksering teknikken å forbedre kontrasten for * lys26 og tillegg av glutaraldehyde og pikrinsyre løsning etappe, den stabiliserende løsningen å forbedre antistoff gjennomtrenging og behold i nevrale Ultrastructure27. Mild fryse-Tin permeabilization gir bedre bevaring av fine struktur, mens osmication og harpiks innebygging redusere z-plane krymping28. I tillegg forbedres visualisering av veldig fine strukturer (fine axons med liten boutons for eksempel) med rugende avsnittene med H2O2 og NaBH4 å redusere bakgrunnen flekker. Kontrasten kan også økes med tillegg av NiCl2 HRP reaksjonen.
Histologiske prosedyren finnesher tilbyr gode resultater reproduserbarhet og pålitelighet. Men bestemmer hele elektrofysiologiske opptakene kvaliteten på biocytin/fluorescens flekker, med kortere innspillinger vanligvis forbundet med dårlig axonal flekker. Valg av opptak protokoller (intracellulær opptak med skarpe elektroder vs hele celle oppdateringen clamping) kan også påvirke biocytin oppbevaring og bevaring av fine anatomi.
Mens vanskelighetene oppstått i bevare fine struktur under histologiske behandling beskrevet her og tiden det tar å rekonstruere på 100 X forstørrelse (1-4weeks avhengig av kompleksiteten av axon) er verdsatt, denne metoden gir et nøyaktig gjengivelse av dendrittiske og axonal diameter. Bruk av mindre krevende protokoller å avdekke biocytin-merking er forståelig, men dette utelukke ofte tydelig visualisering av fine axonal grener. Vaskemidler, å fremme oppføring av Avidin-HRP å avsløre biocytin og antistoffer, er ofte nødvendig i tykke snitt, men kan forstyrre fine struktur. Nevrologer søk stadig for halvautomatisk metoder for gjenoppbygging, men for forblir nå og for axons spesielt biocytin-HRP med manuell rekonstruksjon gullstandarden31.
Svært detaljert neuronal rekonstruksjoner, spesielt nøyaktige tegninger av axonal boutons og noder, tilstedeværelse eller fravær av myelin og mer generelt tegning av komplett axonal arbor, med representasjon av nøyaktig axon diameter endrer langs sin lengde, gir ytterligere informasjon for nøyaktig identifikasjon av en distinkt type interneurone. Selv om mange interneurons ikke kanskje passer nøyaktig til en bestemt klasse, inneholder teknikken beskrevet ovenfor samsvarende data neuronal elektrofysiologiske egenskaper, kortsiktige plastisitet forbundet med en bestemt type tilkobling og detaljert neuronal rekonstruksjoner, tillater koblingsskjemaet, i ca 2-regionen, for eksempel å bli studert i detalj.
Fine, detaljert struktur er ofte forenklet i beregningsorientert modeller. Mens forståelig, resulterer dette i tap av informasjon som kan være viktige i fremtiden. Analyse av detaljert 3D rekonstruksjoner med parallell synaptic data vil tillate tillegg av flere kriterier for interneuronal klassifisering. Data kan deponeres i offentlige repositories og brukes av modellerere for å utforske utfallet av sporadiske endringer i axon diameter og myelination på handlingen potensial forplantning beregningsmessig.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen har mottatt finansiering fra Medisinsk Forskningsråd til Prof Alex Thomson, bioteknologi og Biological Sciences Research Council (BBSRC-BB/G008639/1), fysiologiske samfunnet, EUs og Novartis Pharma (Basel) Horizon 2020 rammeprogram for forskning og innovasjon under feltet bestemt Grant avtalen. 720270 (menneskelige hjerne prosjektet SGA1) og under feltet bestemt Grant avtalen. 785907 (menneskelige hjerne prosjektet SGA2). Vi er svært takknemlig til Prof Alex Thomson konfigurere protokollen i andre kortikale områder, sikre finansiering og hennes kontinuerlig støtte for dette prosjektet. Bidrag fra lab-medlemmer som bidro til å optimalisere utvinningen protokollen og rekonstruert CA2 neurones er takknemlig anerkjent: J. Deuchars H. Pawelzik D. I. Hughes, A. P. Bannister, K. Eastlake, H. Trigg, N. A. Botcher.
Avidin-7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid (Avidin-AMCA) antibody- 20.8 mg/mL | Vector laboratories | A2008 | |
Biocytin ≥98% (TLC) | Sigma | B4261 | |
3,5 diaminobenzidine (DAB) tablet, To prepare 5 mL | Sigma | D4293 | |
Durcupan epoxy resin A | Sigma | 44611 | |
Durcupan epoxy resin B | Sigma | 44612 | |
Durcupan epoxy resin C | Sigma | 44613 | |
Durcupan epoxy resin D | Sigma | 44614 | |
Ethanol, puriss. p.a., absolute, ≥99.8% | Sigma | 32221 | |
Gelatin | Sigma | 48723 | |
Glutaraldehyde solution, grade I, 25 % in H2O | Sigma | G5882 | |
Glycerol, ≥99% | Sigma | G5516 | |
Goat serum | Sigma | G9023 | |
Goat anti-mouse fluorescein isothiocyanate (FITC)- 14.3 mg/mL | Sigma | F2653 | |
Goat anti-rabbit Texas Red (TR)- 3.3 mg/mL | Invitrogen | T2767 | |
Hydrogen peroxide, 30% solution | Sigma | H-1009 | |
Immersion oil, viscosity 1.250 cSt (lit.) | Sigma | I0890 | |
Nickel chloride (NiCl2 . 6H2O) | Sigma | N5756 | |
Osmium tetroxide, for electron microscopy, 4% in H2O | Sigma | 75632 | |
Paraformaldehyde, reagent grade, crystalline | Sigma | P6148 | |
Picric acid, moistened with water, ≥98% | Sigma | 197378 | |
Phosphate buffer 1 M | Sigma | P3619 | |
Propylene oxide (C3H6O), 99% | Alfa Aesar | 30765 | |
Sodium tetrahydroborate | VWR | 27885.134 | |
Sucrose | Fisher scientific | S/8600/53 | |
Trizma Hydrochloride, ≥99.0% | Sigma | T5941 | |
Trizma base, ≥99.9% | Sigma | T6066 | |
Vectashield Antifade Mounting Medium, , refractive index 1.45 | Vector laboratories | H-1000 | |
Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector laboratories | PK6100 | |
Equipment used | |||
Vibratome | Agar Scientific | ||
C4A Cupped aluminium planchettes | GA-MA & ASSOCIATES, INC. | ||
Leica DMR microscope | Leica Microsystems | ||
X-Cite 120PC Q fluorescence light source | Excelitas Technologies | ||
Leica DFC450 digital microscope camera | Leica Microsystems | ||
Rapidograph technical drawing pen 0.18mm | London graphics centre | ||
0.18mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
Rapidograph technical drawing pen 0.25mm | London graphics centre | ||
0.25mm rapidograph nib | London graphics centre | ||
Neurolucida system including PC workstation, stage, camera and joystic for XYZ stage control | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
Neurolucida software version 2017 | Microbrighfield (MBF) Bioscience | ||
CorelDRAW graphics Suite X5 | Corel | ||
Video editing software | Adobe Premiere Pro | ||
Glass vials 14 mL | Fisher scientific |