Questo manoscritto descrive la sintesi di un nanotubo di carbonio a parete singola (SWCNT)-coniugato MALAT1 gapmer antisenso del DNA oligonucleotide (SWCNT-anti-MALAT1), che dimostra la consegna affidabile del SWCNT e il potente effetto terapeutico di anti-MALAT1 in vitro e in vivo. Metodi utilizzati per la sintesi, la modifica, la coniugazione e iniezione di SWCNT-anti-MALAT1 sono descritti.
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Articolo metodologico
Repressione della crescita delle cellule di mieloma multiplo In Vivo di nanotubi di carbonio a parete singola (SWCNT)-consegnato oligo antisenso MALAT1
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
I nanotubi di carbonio a parete singola (SWCNT) sono un nuovo tipo di nanoparticelle, che sono stato utilizzato per fornire più tipi di farmaci nelle cellule, come proteine, oligonucleotidi e droghe sintetiche della piccolo-molecola. Il SWCNT ha dimensioni personalizzabili, un'ampia area superficiale e non può vincolare in modo flessibile con farmaci attraverso diverse modifiche sulla sua superficie; Pertanto, è un sistema ideale per il trasporto di farmaci nelle cellule. RNA lunghi non codificanti (lncRNAs) è un cluster di RNA non codificante più di 200 nt, che non può essere tradotto in proteina, ma svolgono un ruolo importante nei processi biologici e fisiopatologici. Trascrizione di adenocarcinoma polmonare metastasi-collegata 1 (MALAT1) è un lncRNA altamente conservata. È stato dimostrato che i livelli elevati di MALAT1 sono relazionati con la prognosi difficile di vari cancri, compreso il mieloma multiplo (MM). Abbiamo rivelato che MALAT1 regola la morte delle cellule e la riparazione del DNA in MM; così, MALAT1 può essere considerato come un obiettivo terapeutico per MM. Tuttavia, la consegna efficiente dell'oligo antisenso per inibire/atterramento MALAT1 in vivo è ancora un problema. In questo studio, abbiamo modificare il SWCNT con PEG-2000 e coniugato un oligo di anti-MALAT1 ad esso, testare la consegna di questo composto in vitro, iniettare per via endovenosa un modello di topo MM diffuso e osservare un'inibizione significativa di progressione di MM, che indica tale SWCNT è una navetta di consegna ideale per gapmer anti-MALAT1 del DNA.
Introduzione
Il SWCNT è un nanomateriale romanzo in grado di fornire vari tipi di droghe, come acidi nucleici, proteine e piccole molecole stabile ed efficiente con ideale tollerabilità e minima tossicità in vitro1 e vivo in2. Un SWCNT funzionalizzati ha solubilità ottima biocompatibilità e acqua, può essere utilizzato come un servizio di navetta per molecole più piccole e può portarli per penetrare la membrana cellulare3,4,5.
lncRNAs sono un cluster di RNA (> 200 nt) che sono trascritti dal genoma al mRNA ma non ....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti che coinvolgono gli animali erano pre-approvati da la Cleveland Clinic IACUC (Comitato di uso e istituzionali Animal Care).
1. sintesi di SWCNTs funzionalizzati
- Mescolare 1 mg di SWCNTs, 5mg di DSPE-PEG2000-ammina e 5 mL di acqua sterilizzata nucleasi-free in una fialetta di scintillazione (20 mL). Agitare bene per dissolvere completamente tutti i reagenti.
- Sottoporre ad ultrasuoni il flaconcino in un sonicatore vasca di acqua ad un livello di potenza di 40 W per 1 h a temperatura ambiente (RT, 20 min x 3, cambiare l'acqua ogni 20 min per evitare il surriscaldamento). E centrifugare a 24.000 x g....
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Risultati
Per dimostrare l'effetto di inibizione di anti-MALAT1 gapmer DNA in MM, abbiamo buttato giù l'espressione di MALAT1 e usato in cellule H929 e MM.1S. Quarantotto ore più tardi, le cellule sono stati raccolti per l'analisi dell'efficienza di abbattimento e lo stato di apoptosi in cellule trasfettate con anti-MALAT1 gapmer o controllo del DNA. risultati di qRT-PCR ha mostrati che anti-MALAT1 gapmer DNA abbattuto l'espressione di MALAT1 in cellule H929 e MM.1S in modo efficiente (
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Discussione
La prova ha indicato che lncRNAs prendere parte nella regolazione di numerose procedure fisiologiche e patofisiologiche nei cancri, compreso MM7,8,9; Essi hanno il potenziale per essere mirati per il trattamento del cancro, che può essere realizzato da oligonucleotidi antisenso20,21,22. L'US Food and Drug Administration (FDA) ha approva.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il Lerner Research Institute proteomica, genomica e imaging core per la loro assistenza e supporto. Finanziamento: Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente da NIH/NCI grant R00 CA172292 (per J.J.Z.) e fondi di Start-up (a J.J.Z.) e la clinica e traslazionale Science Collaborative (CTSC) della Case Western Reserve University Core utilizzazione pilota Grant (a J.J.Z.). Questo lavoro utilizzata il microscopio confocale Leica SP8 che è stato acquistato con un finanziamento da istituti nazionali di salute SIG grant 1S10OD019972-01.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| SWCNTs | Millipore-Sigma | 704113 | |
| DSPE-PEG2000-Ammina | Avanti Polarizzazione dei lipidi polari | 880128 | |
| bagnoschiumatore | VWR | 97043-992 | |
| Filtro centrifugo da 4 mL | Millipore-Sigma | Z740208-8EA | |
| Thermo Fisher Scientific | accuSkan GO Spettrofotometro | UV/Vis per micropiastrecoefficiente di estinzione di 0,0465 L/mg/cm a 808 nm | |
| Sulfo-LC-SPDP | ProteoChem | c1118 | |
| Soluzione DTT | Millipore-Sigma | 43815 | |
| NAP-5 colonna | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
| sistema di imaging in vivo | PerkinElmer | ||
| NOD. CB17-Prkdcscid/J topi | Charles River lab | 250 | |
| Citometro a flusso | Becton Dickinso | ||
| Lipofectamina | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamin2000 |
| Siero fetale bovino (FBS) | Invitrogen | 10437-028 | |
| RMPI-1640 medio | Invitrogen | 11875-093 | |
| MALAT1-QF: | sintetizzato da IDT Azienda | 5'- GTTCTGATCCCGCTGCTATT - 3' | |
| MALAT1-QR: | sintetizzato da IDT Company | 5'- TCCTCAACACTCAGCCTTTATC - 3' | |
| GAPDH-QF: | sintetizzato da IDT Company | 5'- CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG - 3' | |
| GAPDH-QR: | sintetizzato da IDT Company | 5'- CTACATGGCAACTGTGAGGAG - 3' | |
| PCR quantitativa utilizzando la master mix SYBR Green PCR | Thermo Fisher Scientific | A25780 | |
| RevertAid kit di sintesi di cDNA di primo supporto | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
| anti-MALAT1 | sintetizzato da IDT Company | 5'-mC*mG*mA*mA*mA*C*A*T*T *G*G*C*A*C*A*mC*mA*mG*mC*mA-3' | |
| Kit di analisi della vitalità cellulare | Promega Corporation | G7570 | Kit di analisi della vitalità cellulare luminescente |
| accuSkan GO Spettrofotometro per micropiastre UV/Vis | Thermo Fisher Scientific | ||
| Filtro centrifugo | Millipore-Sigma | UFC910008 | |
| SPSS Software | IBM | versione 24.0 | |
| D-Luciferin | Millipore-Sigma | L9504 |
Riferimenti
- Jiang, X., et al. RNase non-sensitive and endocytosis independent siRNA delivery system: delivery of siRNA into tumor cells and high efficiency induction of apoptosis. Nanoscale. 5 (16), 7256-7264 (2013).
- Murakami, T., et al.
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Ristampe e permessi
