Denne artikkelen presenterer en storfe melkekjertlene biopsi bruke kjerne og nål biopsi verktøy. Høstet vev kan brukes for cellekultur eller å vurdere mammary fysiologi og metabolisme inkludert genuttrykk, protein uttrykk, protein modifikasjoner, immunohistochemistry og metabolitten konsentrasjoner.
Storfe melkekjertlene biopsier tillate forskere å samle vevsprøver å studere cellebiologi inkludert genuttrykk, histologiske analyse, signalnettverk trasé og protein oversettelsen. Denne artikkelen beskriver to teknikker for biopsi i bovin melkekjertlene (MG). Tre sunn Holstein mjølkekyr var fagene. Før biopsier, kyr melket og senere restriktiv storfe rutsjebane. En analgesic (flunixin meglumine, 1.1 til 2,2 mg/kg kroppsvekt) ble administrert via jugulare intravenøs [IV] injeksjon 15-20 min før til biopsi. For stående sedasjon, xylazine hydroklorid (0.01 til 0.05 mg/kg kroppsvekt) ble injisert via coccygeal fartøyene 5-10 min før prosedyren. Når tilstrekkelig bedøvet, var området biopsi tas aseptisk forberedt og lokalt anaesthetized med 6 mL av 2% lidokain hydroklorid via injeksjon. Bruker steril teknikk, ble en 2-3 cm loddrett snitt gjort med nummer 10 skalpell. Kjernen og nål biopsi verktøy ble brukt. Kjernen biopsi verktøyet var knyttet til en Oppladbar drill og inn MG vevet gjennom snittet en clock-wise bore-handlingen. Verktøyet nål biopsi var manuelt satt inn i såret området. Umiddelbart etter inngrepet, assistent brukt press på snitt i 20 til 25 minutter bruke et sterilt håndkle for å oppnå hemostasen. Rustfritt stål kirurgisk stifter ble brukt til å motsette seg den hud snittet. Stiftene var fjernet 10 dager etter prosedyren. De viktigste fordelene med core og nål biopsier er at begge tilnærminger er minimal invasiv prosedyrer som kan utføres sikkert friske kyr. Melk avkastning etter biopsy var upåvirket. Disse fremgangsmåtene krever en korte utvinning tid og resultere i mindre risiko for komplikasjoner. Spesifikke begrensninger kan inkludere blødning etter biopsi og infeksjon på webområdet biopsi. Programmene av disse teknikkene omfatter vev samling for klinisk diagnose og forskningsformål, for eksempel primær cellekultur.
En biopsi er en prosedyre for å høste en kjernen del av fag for medisinsk eller forskningsformål. Det er en minimal invasiv og utbredt teknikk å samle vev som et alternativ til euthanasia1 analyse av vev svar til behandling eller andre faktorer av interesse. Prøver av bovin melkekjertlene (MG) vev er avgjørende for meieri forskning å studere genet og protein uttrykk, histology, organiseringen av mobilnettet organeller, signalveier og metabolske prosesser i respons på endringer i ledelsen eller miljø. I tillegg er MG vev nødvendig for å diagnostisere og forskning visse infeksjonssykdommer, som storfe mastitt forårsaket av bakterielle infeksjoner2.
I juret kyr inneholder fire separate kjertler og hver kjortelen behersker en uavhengig melk sekretoriske system kollektivt kalt parenchyma. Den alveoler, rør og bindevev finnes i den mammary parenchyma. Spesialisert myoepithelial celler på den ytre overflaten (basale) alveoler er mikroskopiske sfærisk hul strukturer som består av epitelceller i interne overflaten (luminal). Alveoler er ansvarlige for syntese og sekresjon av melk. Fibrøs connective vev i parenchyma kan skille en gruppe alveoler fra andre grupper av alveoler, og hver gruppe kalles en lobule3. Flere faktorer kan påvirke utvikling og funksjon av MG inkludert dyr fysiologi, ernæring, ledelse, genetikk og miljø4. Mastitis er også en kritisk faktor som negativt påvirker MG funksjon og melk kvalitet5. Den giftstoffer ut av mastitic patogener kan skade alveoler og indusere nekrose resulterer i biokjemiske og histologiske endringer i MG vev6. Dermed være kan histology og metabolske prosesser hver alveoler eller lobule i MG vesentlig forskjellig fra andre. Slik er biopsier som er representative utvalg av hele melkekjertlene ønskelig. Liten biopsies kan bare ta en enkelt lobule eller personlige alveolus, begrenser vitenskapelig eller diagnostiske resultatinformasjonen. Til forskningsformål, er det nødvendig å være klar over at en mammary biopsi gir et “øyeblikksbilde” av vevet egenskaper, men en biopsi ikke tilstrekkelig karakterisere mammary sammendragsfunksjon i fravær av anslag over total melkekjertlene masse.
Flere biopsi verktøy har blitt utviklet over de siste 30 årene for menneskelig bruk. Foreløpig er tilpasninger av disse instrumentene tilgjengelig for bruk med dyr. For melkeku, er prøver av MG vev anskaffet ved hjelp av forskjellige teknikker inkludert inngrep forbrukeravgift (sløv disseksjon)7og biopsi nåler1,8core biopsi instrumenter9,10. Dermed har MG biopsi teknikker i ammende mjølkekyr overført fra prosedyrer som bruker liggende sedasjon med kirurgisk disseksjon bruke electrocautery hemostasen i 19927 til samling av kjernen biopsier under stående sedasjon9, 10,11,12. Kirurgisk biopsi er en invasiv metode, som kan være dyrt og har en høyere forekomst av komplikasjoner som hematom, sår problemer, og svulst spre13. Foreløpig har kjernen biopsi og håndarbeide biopsy (også kjent som en tru-kutt biopsi) vært allment vedtatt som alternativer til kirurgisk biopsi. Fordelene med core og nål biopsier sammenlignet med kirurgisk biopsi inkluderer: prosedyren er minimal invasiv; store komplikasjonene er sjeldne; generell anestesi er ikke nødvendig; prosedyren er slektning rask; Utvinningen tid er kort; Det er minimal negative effekter på udder helse og bare kortsiktige effekter på melk avkastning og komposisjon8,9,10; kostnadene er mindre enn kirurgisk biopsi13.
En kjerne biopsi fremgangsmåten som er beskrevet i 1996 brukes en steril, rustfritt stål kanyle med flyttbare uttrekkbar blad fjerne en representant mengden vev fra storfe MG uten narkose9,10,11 ,12. Under inngrepet, var maskinen festet til en Oppladbar drill til å lage en lav hastighet, roterende bevegelse som ren kutte en vev kjerne som verktøyet var avansert inn i vevet. Fordelen var en større vev prøve (70 x 4 mm i diameter, ca 0,75 1 g) 9. En fersk studie10 viste at biopsi prosedyren beskrevet av V. C. Farret al. 9 kan brukes til å utføre gjentatte MG vev samlinger uten negativ innvirkning på ytelsen og udder helse ammende mjølkekyr. Nylig ble en studie14 gjennomført i melkekyr å evaluere gjentatte biopsies av MG med en større trocar (31 cm lang, ytre diameter 9.5 mm, indre diameter 8 mm) med vakuum brukt en interne rustfritt stål kanyle for å samle biopsy . Denne metoden brukes sedasjon (xylazine) og lokal anestesi (2% lidokain hydroklorid).
Håndarbeide biopsy er en annen teknikk for å samle mammary vev. Flere studier har vedtatt denne teknikken. 1 studier brukt sedasjon (detomidine) og lokal bedøvelse (1% lidocaine) i prosedyren. Etter biopsy fikk kyrne en forebyggende antibiotikabehandling. Melkekjertlene var manuelt massert før og etter den melking. Blod i melk ble observert til 84 h etter biopsy. Mengden og sammensetningen av melk ble berørt i en kort tidsperiode. Nylig brukt en studie en biopsi nål for å utføre gjentatte MG biopsi i mjølkekyr8. Sedasjon (1% acepromazine, intramuskulær) og lokal anestesi (2% lidokain hydroklorid, subkutan) ble utøvet på dyrene. Dyrene får ikke intramammary narkotika eller antibiotika før eller etter inngrepet, og det var ingen tegn til infeksjon på webområdet biopsi i post-kirurgiske perioden. I denne studien hadde gjentatte bovin MG biopsier bruker en nål, mindre negativ innvirkning på melk produksjon og udder helse mjølkekyr. Generelt synes håndarbeide biopsy å være en mindre invasiv metode enn kjernen biopsi instrumentet. Men som nevnt tidligere, er det avgjørende for biopsi teknikken å høste et representativt utvalg av MG vev. Begrensning av en håndarbeide biopsy er at en liten mengde bovin MG vev er oppnådd (ca 20 til 25 mg)8,15.
Nesten alle studiene brukte en kombinasjon av α-2 Agonistiske sedasjon og lokal bedøvelse8,9,10, om biopsy var via en nål eller en større kjerne. I bovin MG knyttes de fleste nerveender huden. Gir til parenchymal vev er hovedsakelig via strekk reseptorer sparsom type en nerve fibre å oppdage skarp kirurgisk smerte. Resultatet er fysiologiske mekanismene av smerte på grunn av kirurgisk manipulasjon av MG via hud og subkutant vev3 og ikke dypt vev som parenchymal vev. Derfor for biopsi prosedyrer er det bare nødvendig å bedøve lokalt huden og underhud vev, som infiltrasjon av lokal bedøvelse i dypere vev ikke betydelig redusere kirurgisk smerte. Etter en passende forberedelse av området biopsi er dyr ubehag, hovedsakelig forbundet med tilbakeholdenhet.
Samling av større kjerneprøver kan øke hematom dannelse og øke risikoen for infeksjon i MG parenchyma. Derfor inkluderer peri-operative protokoller ofte administrasjon av parenteral antibiotika7, men det ikke er universals8. Oppnå hemostasen er også en viktig faktor for å redusere ku sykelighet. I nevnte studien bruker en stor kjernen biopsi instrument14, manuell trykk ble brukt til biopsi området og ku BH ble brukt til å bruke is sår minst 2 h følge fremgangsmåten. Den store mengden vev høstet, bare små reduksjoner i feed inntak og melk yield ble observert og prosedyren ble gjentatt hver tredje uke uten negative effekter på ku helse.
Forskere utfører MG biopsi i mjølkekyr må vurdere diagnostiske eller analytiske kvaliteten på den resulterende biopsy, teknikk og ku sykelighet. Nøyaktig og pre-planlagte kirurgiske teknikker er viktig å oppnå disse målene. Hittil MG biopsi studier har fokusert på å beskrive biopsi resultater, i motsetning til som beskriver biopsi teknikken, og beskrivelser for ammende melkekyr mangler tilstrekkelig detalj slik at replikering. Dermed var formålet med dette verket å beskrive både håndarbeide biopsy og større kjernen biopsi teknikker i tilstrekkelig detalj tillate sikker og Human replikering av MG biopsi kyr.
Kjernen og nål biopsi metoder ble beskrevet i denne protokollen9,16. En detaljert vurdering av dyrehelse og forekomsten av mastitt14 før biopsy kreves for begge prosedyrer. Til forskningsformål, bør utføre teknikken i dyr med tydelig underskriver av betennelse eller smittsomme sykdommer unngås. Dette vil redusere risikoen for komplikasjoner under og etter en biopsi. Biopsi instrumenter og enheter bør være rene, desinfiseres og sterilisert å unngå forurensning av webområdet biopsi. Før prosedyren er det nødvendig å minimere kirurgiske området infeksjoner (SSI). Generelt, er SSI tilknyttet dyr sykelighet, tapt ytelse og høyere kostnader i mjølkekyr. Studier rapportert tidligere metoder for å hindre at SSI på grunn av biopsi inkludert klipping håret rundt såret området, vaske biopsi området for å fjerne forurensning9,14, og bruker antiseptisk agenter (70% alkohol, jod kirurgisk skrubbe9, 2% chlorhexidine acetate løsning14, 10% povidon-jod8) for huden forberedelse. I noen studier, ble administrasjon av antibiotika vedtatt under7 eller umiddelbart etter biopsi9; men antibiotika profylakse ble ikke brukt i dette arbeidet, og ingen infeksjoner av biopsi området ble observert. For å hindre forurensning av biopsi sår, skal halen være sikret for å unngå kontakt med biopsi området til aerosol bandasjen er utlignet. I denne protokollen fjernet stifter ca 10 til 14 d etter biopsy.
Før en kjerne biopsi er det viktig å riktig sette opp verktøyet og knytte den til drill; velge en langsom hastighet, Velg frem rotasjonen og bruker ikke omvendt modus av bore. I prosedyren er det viktig å bruke digital press på begge sider av innsnitt å holde huden kantene fra hverandre og har en lang nok snitt tillate verktøyet oppføringen uten kontakter huden eller bindevev. Hvis denne fremgangsmåten ikke gjøres, kan en dra på snitt kantene under rotasjon av kjernen biopsi instrumentet oppstår og forårsake ekstra hud vev traumer som øker risikoen for infeksjon og kan forsinke sårheling. Nåværende biopsi prosedyrene som er beskrevet i denne protokollen ble utført av en bord-sertifisert store dyr kirurg. Prosedyrene ble utført (figur 5). Begge teknikkene er relativt enkelt og raskt å utføre sammenlignet med kirurgisk excision prosedyren.
Blødning fra webområdet biopsi er vanlig etter MG biopsi i mjølkekyr8,9,10,14. I den nåværende protokollen, blødning observert var minimal (Figur 4), som kan være av anvendelse av tilstrekkelig (sterk) press på såret umiddelbart etter inngrepet. Sterkt press for minst 20 min kreves, og det kan være nødvendig i mer enn 30 min i noen tilfeller. Hvis moderat til alvorlig blødning er observert etter anvendelse av press på biopsi området, anbefales det å fortsette press, og umiddelbart kontakte veterinær.
Hemostasen er en viktig faktor for å redusere ku sykelighet, pakket en studie hemostatic pads i området biopsi å kontrollere blødning9. Bruk av hemostatic pads på en måte har imidlertid en potensiell risiko i mikrobiologisk forurensning i melkeprodusenter miljøet. En annen studie14 brukes manuell trykk til biopsi området mellom gjentatte biopsier og etter biopsi og huden lukking, og is på nettstedet for minst 2 timer etter biopsy. I den nåværende protokollen var sterkt press på webområdet biopsi i 20 til 25 min tilstrekkelig til å kontrollere blødning.
En vellykket biopsi teknikk skal resultere i minimum blod i melken som vedvarer for en kort periode etter inngrepet. For å unngå et avbrudd i melk sekret under melk letdown og mastitt infeksjoner, bør intramammary blodpropp fjernes hånd stripping biopsied kvartal10,14. I stede protokollen, ble blod observert i melk opptil 48 h etter biopsy. Men i en studie som brukes flere dyr, ble blod i melk observert i fleste kyr for mindre enn 6 dager. Få dyr viste blod i melk etter 6 dager8. Derfor er daglig observasjon av melk utseende nødvendig for 6 d etter inngrepet. Dyr ikke viser noen tegn til mastitt infeksjon når en stor Vevsprøve ble innhentet14. Men fant tidligere undersøkelser som utføres gjentatte biopsier på samme dyret bruker en nål, at mastitt infeksjon insidensen var ca 12% etter prosedyren8. I den nåværende protokollen hadde ingen dyr visuelle tegn på klinisk mastitt infeksjon etter inngrepet. Det er også en liten sjanse for at webområdet snitt kan bli smittet etter biopsy.
Tolazoline hydroklorid, et stoff som reverserer effekten av sedasjon, skal finnes ved en overdose fra xylazine. En høy dose av xylazine kan forårsake lungeødem. Klinisk underskriver av lungeødem inkluderer luftveissykdom, alvorlig dyspné, pustevansker, hoste og skummende sputum. Hvis tegn på lungeødem er observert, anbefales det å bruke tolazine (2-4 mg/kg kroppsvekt) å reversere xylazine effektene.
Nåværende protokollen beskriver teknikken for å utføre en håndarbeide biopsy og kjernen biopsi. Generelt, er fordelen av en kjerne biopsi sammenlignet med håndarbeide biopsy større vev utvalg (0,75 1 g)9 med minst mulig negativ effekt på udder helse. Håndarbeide biopsy er en mindre invasiv metode enn kjernen biopsi instrumentet. Imidlertid forsøker flere biopsi å hente en større mengde vev ved hjelp av en nål biopsiprosedyre kan øke risikoen for stor blødning etter prosedyren, i tillegg til blodpropp i melken. Begge teknikkene forårsaket minimal ku sykelighet og var lett oppnås med minimal trening av kirurgiske personell. En kortsiktig endring i daglig melk avkastning (8 til 10% reduksjon) og komposisjon9 og fôrinntak reduksjon14 forventes etter de kjernen og nål biopsier, henholdsvis. Nål biopsi prosedyrens begrensninger er små volumet av vev fjernet med nålen. Apparatet må aktiveres bare når nålen er i vevet skal biopsied og flere forsøk ofte er nødvendig for å oppnå tilstrekkelig mengder vev, som øker risikoen for blod i melk og mastitt etter inngrepet. Begrensninger av kjernen biopsi omfatter en høyere risiko for blødninger etter prosedyren hvis mye vev (> 200 mg) er oppnådd. Dessuten er biopsy verktøyet vanskeligere å montere krever tilstrekkelig opplæring før bruk.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av National Animal ernæringsprogram og Virginia Tech. Teknisk assistanse av Ms. Tara Pilonero, Dr. Julie Settlage og Dr. Izabelle Teixeira er takknemlig anerkjent.
70% Isopropyl alcohol | Walmart | 565106257 | 1 L |
Aerosol spray to kill and repel flies | MWI | 14339 | 1 bottle (if necessary) |
Biopsy needles, 12 G × 16 cm | C. R. Bard | MN1216 | 2 |
Butterfly infusion set (18 G needle) | Fisher | 22-258087 | 1 |
Cell culture dishes | Fisher | 08-772E | 4 |
Cordless drill (low speed) | Hitachi | DS10DFL | 1 |
Core biopsy instrument, Farr et al. (1996) | 2, custom metal fabrication. To request the tool contact the authors. | ||
Cows | cattle healthy | ||
Flunixin meglumine | MWI/VetOne | 501018 | 1.1 to 2.2 mg/kg of body weight |
Folding table | Amazon | 1 | |
Forceps | Fisher | 09-753-50 | 1 |
Gloves non-sterile | Fisher | 17-200-845 | 9, size dependent |
Hard brush | Sullivan Supply | 18270 | 1, to wash the cows |
Head gate | 1, customized for dairy cows | ||
Lidocaine hydrochloride 2% injectable | MWI/VetOne | 510212 | 6 mL was used, from 3 to 8 mL |
Livestock body wash | eZall Technologies | 39384 | 1, to wash the cows |
Needle 18 G (1 to 1/5“) | Fisher | 14-821-15A | 6 |
Needle 20 G (1 to 1/5“) | Fisher | 14-815-526 | 6 |
Phosphate buffered saline (0.9%) | Fisher | 20-012-043 | 1 L |
Povidone Iodine ointment | Jeffers | #VED1A | 500 g (if necessary) |
Povidone iodine scrub solution (0.75% iodine) | MWI/VetOne | 510094 | 1 L |
Reusable biopsy instrument | C. R. Bard | MG1522 | 1 |
Rope halter | Nasco farm and ranch | C10852 | 2, cow size |
Scalpel blades (#10) | MWI | 033870 | 2 |
Scalpel holders (#3) | MWI | 602008 | 1 |
Self seal autoclave pouch 10 x 5.5 in. | Fisher | 19-130-0038 | 1 case of 800 |
Sterile cotton gauze sponges | Fisher | 22-037-986 | 4 |
Sterile gauze pads | Fisher | 19-090-735 | 4 |
Sterile surgical gloves | Surgical gloves | 19-166-679 | 3, size dependent |
Sterile surgical towels | Fisher | 50-118-0339 | 6 |
Stethoscope | Littmann Master Classic II | 1392 | 1 |
Surgical clipper | Oster A5 | 078005-010-003 | 1, preparation of the animal for biopsy |
Surgical clipper blades (#40 ) | Oster | 78919-016 | 1, preparation of the animal for biopsy |
Surgical staple remover | MWI | 541 | 1 |
Surgical stapler pre-loaded | MWI | 17713 | 5 |
Syringes of 10 mL | Fisher | 14-823-224 | 3 |
Syringes of 2 mL | Fisher | 22-028854 | 3 |
Syringes of 20 mL | Fisher | 22-034507 | 3 |
Syringes of 5 mL | Fisher | 22-028855 | 3 |
Thermometer | Agri-Pro Enterprises Inc | 72000 | 1 |
Tolazine hydrochloride | Akorn Animal Health | 61311-486-10 | 2 to 4 mg/kg of body weight (if necessary) |
Tweezer | Fisher | 14-955-025 | 1, for handle the tissue sample |
Water hose | Miracle-Gro, Walmart | 554990501 | 1, to wash the cows |
Water-resistant aerosol bandage (aluminum powder 40 mg) | MWI | 010728 | 1 bottle |
Xylazine hydrochloride | MWI/VetOne | 510650 | 0.01 to 0.05 mg/kg of body weight |