Analisi metagenomica quasi di Salmonella da campioni ambientali e alimentari
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per preparare campioni di DNA da alimentare e ambientale microbiomi per rilevamento concertato e tipizzazione di Salmonella mediante sequenziamento di quasimetagenomic. L’uso combinato di arricchimento della cultura, separazione immunomagnetica (IMS) e cilindrata più amplificazione (MDA) permette efficace concentrazione del DNA genomico di Salmonella da campioni ambientali e alimentari.
Abstract
Quasi-metagenomica sequenziamento si riferisce all’analisi basata su sequenziamento dei microbiomi modificate di cibo e campioni ambientali. In questo protocollo, microbiome modificazione è progettato per concentrare il DNA genomico di un contaminante di agente patogeno alimentare destinazione per facilitare l’individuazione e definizione di sottotipo dell’agente patogeno in un unico flusso di lavoro. Qui, spiegare e dimostrare la procedura di preparazione del campione per l’analisi metagenomica quasi di Salmonella enterica da alimentari rappresentativi e campioni ambientali tra cui germogli di erba medica, pepe nero macinato, macinato di manzo, petto di pollo e tamponi ambientali. Campioni vengono prima sottoposti all’arricchimento della cultura della Salmonella per una durata ridotta e regolabile (4 – 24 h). Salmonella cellule quindi vengono acquisite in modo selettivo dalla coltura di arricchimento di separazione immunomagnetica (IMS). Infine, amplificazione multipla di cilindrata (MDA) viene eseguita per amplificare il DNA dalle cellule di IMS-catturato. L’output di DNA del presente protocollo possa essere sequenziato da piattaforme di sequenziamento di throughput elevato. Un’analisi PCR quantitativa opzionale può essere eseguita per sostituire sequenziamento per rilevamento di Salmonella o valutare la concentrazione di Salmonella del DNA prima di sequenziamento.
Introduction
Metagenomica sequenziamento permette teoricamente di rilevamento concertato e tipizzazione di agenti patogeni di origine alimentare. Tuttavia, campioni alimentari presentano sfide all’analisi dell’agente patogeno mediante sequenziamento diretto del microbioma cibo. In primo luogo, patogeni di origine alimentare sono spesso presenti a livelli bassi in campioni alimentari. La maggior parte dei metodi di rilevazione rapida commercialmente disponibili ancora richiedono 8 – 48 h coltura per arricchire patogeni e cellule a un livello rilevabile1. In secondo luogo, molti alimenti contengono abbondante microflora cellule e/o cibo del DNA, che rende il DNA di agenti patogeni di origine alimentare una piccola frazione del metagenoma di cibo e un obiettivo sfuggente per rilevazione e definizione di sottotipo di metagenomica sequenziamento diretto.
Modifica del cibo microbiomi è stato segnalato per consentire la notevole concentrazione di patogeni di origine alimentare DNA per facilitare il rilevamento basato sul sequenziamento di Shiga tossina Escherichia coli2,3 e Salmonella enterica4. Perché alimenti microbiomi sono ancora miscele di differenti specie microbiche, loro sequenziamento è definito come di analisi metagenomica quasi4. Microbioma modifica può essere eseguita da cultura arricchimento da solo2,3 , o in combinazione con separazione immunomagnetica (IMS) e più cilindrata amplificazione (MDA)4,5. IMS è in grado di catturare in modo selettivo patogeni e cellule dalla coltura di arricchimento tramite biglie magnetiche rivestite con anticorpo. MDA può generare una quantità sufficiente di DNA genomico per la sequenza attraverso il ɸ29 altamente efficiente della polimerasi del DNA6. IMS-MDA ha permesso il rilevamento del patogeno coltura-indipendente da campioni clinici7e accorciando l’arricchimento della cultura per il rilevamento di quasi-metagenomica e tipizzazione di Salmonella in campioni di cibo4.
L’obiettivo generale di questo metodo è quello di preparare quasi metagenomici DNA da campioni di alimenti per consentire mirate concentrazione del DNA genomico di Salmonella e successivo rilevamento e sottotipizzazione del contaminante Salmonella mediante sequenziamento. Paragonato ai metodi standard per Salmonella rilevamento8,9 e10di sottotipizzazione, l’approccio di quasimetagenomic sostanzialmente possibile accorciare i tempi di turnaround da alimenti contaminati ed i campioni ambientali sottotipi molecolari dell’agente patogeno unificando i due in genere separata analisi in un unico flusso di lavoro. Questo metodo è particolarmente utile per applicazioni come risposta alle epidemie trasmesse da alimenti e altre indagini di schiena traccia dove robusto patogeno sottotipizzazione è richiesto oltre al rilevamento del patogeno e rapida inversione di tendenza analitica è importante.
Protocol
Representative Results
Discussion
A causa della spesso-bassa abbondanza e omogenei in presenza di Salmonella negli alimenti e nei campioni ambientali, arricchimento di cultura prima di IMS-MDA è ancora necessario per il rilevamento di Salmonella e subtyping; è quindi un passo fondamentale del protocollo. Per identificare le condizioni ottimali per aumentare l’abbondanza di Salmonella relativa flora sfondo campione, media diversi arricchimento può essere valutata per gli esempi specifici. Secondo MLG e BAM, sia terreno selett…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare Mark Harrison e Gwen Hirsch della University of Georgia per fornire gentilmente il ceppo batterico e altro supporto a questo studio.
Materials
| Laboratory blender bag w/filter | VWR | 10048-886 | |
| Buffered peptone water | Oxoid Micorbiology Products | CM0509 | |
| Rappaport Vassiliadis broth | Neogen Acumedia | 7730A | |
| Polysorbate 20 | Millipore Sigma | P9416 | Tween 20 |
| Stomacher blender | Seward | 30010108 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75005194 | |
| 50ml Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-6 | |
| Thermal Cycler | Techne Prime | EW-93945-13 | |
| StepOne Real-Time Thermal cycler | Applied Biosystems | 4.76357 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | PCR purification beads; mix well before use; store at 4C |
| Nextera XT library prep kit | Illumina | FC-131-1024 | Store at -80C |
| MinIon library prep kit | Oxford Nanopore | SQK-LSK108 | Store at -80C |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Dynabead Anti-Salmonella beads | Applied Biosystems | 71002 | Vortex well prior to use |
| Illustra GenomiPhi V2 DNA amplification kit (MDA kit) -Sample buffer -Reaction buffer -Enzyme mix |
GE Healthcare | 25-6600-30 | Store at -80C |
| HulaMixer | Invitrogen | 15920D | |
| DynaMag magnetic rack | Invitrogen | 12321D | |
| TaqMan Universal PCR mastermix | Applied Biosystems | 4304437 | Mix well before use; store at 4C |
| Microfuge | Fisher Scientific | 05-090-100 |
Riferimenti
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