I denne artikel vil vise vi hvordan absorberende microbiopsy teknik er udført og hvordan prøven kan bruges til RNA udtræk til enkel og samtidig sampling af huden og blod i en minimalt invasiv måde.
Konventionelle hudbiopsi begrænser den kliniske forskning, der involverer kosmetisk følsomme områder eller pediatric ansøgninger på grund af dens invasionsevne. Her beskriver vi protokol for at bruge en absorberende microneedle-baseret enhed, absorberende microbiopsy, minimalt invasive stikprøver af huden og blod blanding. Vores mål er at bidrage til at lette hurtige fremskridt i klinisk forskning, oprettelsen af biomarkører for hudsygdom og mindske risikoen for klinisk forskning deltagere. I modsætning til konventionelle hud biopsi teknikker, den absorberende microbiopsy kan udføres inden for sekunder og kræver ikke intensiv træning på grund af dens enkle design. I denne rapport beskriver vi brug af absorberende microbiopsy, herunder lastning og program på frivillig. Derefter viser vi hvordan du isolere RNA fra den optagne prøve. Endelig vil demonstrere vi brugen af kvantitative reverse transkription PCR (RT-qPCR) at kvantificere mRNA udtryk niveauer af både blod (CD3E og CD19) og hud (KRT14 og TYR). De metoder, der beskriver vi udnytte off hylden kits og reagenser. Denne protokol tilbyder en minimalt invasiv tilgang til samtidige prøveudtagning af huden og blod inden for den samme absorberende microbiopsy matrix. Vi har fundet menneskelige etiske komitéer, klinikere og frivillige til at være støttende for denne tilgang til dermatologiske forskning.
Hudbiopsi er en af de mest væsentlige teknikker i dermatologi for hud prøveudtagning og efterfølgende diagnosticering af hudsygdomme gennem histopatologisk vurdering. Biopsi teknikken indebærer en læge ved hjælp af et blad eller punch biopsi hen til ophæve den mistænksom læsion på patientens hud for undersøgelse1. Selv om teknikken er effektiv, det er meget invasiv og begrænser kliniske forskning som slutpunktet indebærer sædvanligvis molekylærbiologiske teknikker2,3. Molekylær analyse af hudsygdomme har potentialet til at levere meget specifikke biologiske oplysninger at histopatologiske analyse kan således lette drug discovery og sygdom diagnose4,5. Desuden kan prøve efterspørgsel i mest molekylærbiologiske teknikker er forholdsvis små og føre til en reduktion af brug af dyr og tillader et større antal flergangsbestemmelser. Der er derfor et klart behov for en alternativ teknik, der gør det muligt for Molekylær analyse i klinisk forskning og sænker risikoen for deltagerne.
For at løse sådanne behov i feltet, har vores gruppe udviklet en roman microneedle-baserede diagnostiske platform, absorberende microbiopsy, der giver mulighed for samling af en lille mængde af huden blandet med blod i en enkel og minimalt invasiv måde6. Formålet med denne publikation er at beskrive den absorberende microbiopsy som en prøveudtagning redskab til at lette Molekylær analyse gennem RNA udvinding i klinisk forskning.
Vi har tidligere beskrevet den første version af microbiopsy, hud microbiopsy, som består af en microneedle, lavet af en tre-lags stålplade design at udvinde små stykker af huden væv7. Nyhed i denne enhed kommer fra flere kontaktpunkter fra den microneedle, som tillader effektiv væv udvinding3. Derimod en cirkulær hud punch biopsi giver kun ét kontaktpunkt og simpelthen tårer huden uden at indfange enhver proeve i nogle tilfælde. Baseret på hud microbiopsy, udviklet vi for nylig den absorberende microbiopsy, som har både blod og hud prøveudtagning kapaciteter. Enheden har vist sig at være muligt til brug i ressource-fattige områder i en nyere epidemiologisk undersøgelse6.
På grund af dens enkle design, den absorberende microbiopsy kan udføres inden for et par sekunder og kræver ikke omfattende uddannelse. Derudover lokalbedøvelse er ikke nødvendig, og påføringsstedet forårsage ikke ardannelse. Denne protokol giver mulighed for forskere eller læger uden relevante prøveudtagning uddannelse at få målrettet huden data for Molekylær analyse. Vi forventer microsampling enheder til at blive rutine i huden forskning i fremtiden.
Selv om microbiopsy er blevet rapporteret i andre hud sygdom undersøgelser, der involverede molekylære diagnostiske teknikker6,8,9,10, såsom humant papillomavirus DNA påvisning, denne protokol er først til at vise detaljerne i stikprøven udvinding og forarbejdning af teknikker til den absorberende microbiopsy. Yderligere, dette er den første rapport, der beskriver den relative gen udtryk profilering af huden og blod celler i microbiopsy prøver.
Disse resultater viser, at den absorberende microbiopsy kan bruges som et værktøj til enkel og minimalt invasiv prøveudtagning af huden og blod blanding til molekylær karakterisering. Enheden ansøgning i overensstemmelse med vores protokol er afgørende for at opnå pålidelige resultater, som det fremgår af forskellen i RNA beløb tilbagebetalt med forskellige applikationsprotokoller (figur 3). Når prøven ekstraheres, er den efterfølgende prøve behandling trin for RNA udvinding meget lig etablerede protokoller15,16. Ud fra de første trin i RNA udvinding, der er ændret for den absorberende microbiopsy, er en anden vigtig ændring brugen af RNase-fri vand til at forbedre resultaterne for efterfølgende ansøgninger. Derudover er det værd at nævne, at den reference gen anvendes i denne undersøgelse er RPLP0. RPLP0, hvis funktion er kendt for forskellige celle og væv typer17, er blevet rapporteret som et passende gen til brug i ikke-melanom hudkræft og forstadier læsioner18.
En af de vigtigste begrænsninger for enheden er fjernelse af microbiopsy fra den enhed, som er tidskrævende og potentielt øger chancen for at prøve tab, især for følsomme prøver som RNA. Problemet kan dog overvindes ved Pre-køling alle sterile billedbehandling værktøjer såsom 2 mL microcentrifuge rør, på tøris.
Brugen af den absorberende microbiopsy er enkle og kræver ikke intensiv træning. Konventionelle biopsi er ikke nødvendigt, da microbiopsy tillader Molekylær karakterisering med etablerede molekylære diagnose teknikker, såsom RT-qPCR. For yderligere at kvantificere og demonstrere prøveudtagning evnen af absorberende microbiopsy, blev tidligere litteratur, der involverede RNA udvinding fra menneskelige hudvæv undersøgt. Fra en typisk 3.0 eller 4.0 mm hud punch biopsi, tre undersøgelser har rapporteret ekstraheret RNA beløbene varierede fra 50 til 200 ng per mg af hud væv19,20,21. Sammenligning med 1,43 ng af RNA, der blev gendannet fra den absorberende microbiopsy i gennemsnit (figur 3), vægten af stikprøven hudvævet forventes at vifte fra 0,29-115 µg baseret på de samme forhold som RNA til væv fra huden punch biopsi undersøgelser.
Denne protokol er ikke uden potentielle faldgruber, selvom nogle af problemerne kan løses nemt. For eksempel, foreslog RNA udvinding data en betydelig variation selv med 10-s bedrift tid (figur 3). For at løse problemet, indebærer en potentiel løsning optimering program-protokollen. Parametre såsom kraft påføres huden og holde tid skal testet og optimeret til at reducere variationer i stikprøven udvinding. Andre potentielle spørgsmålet er fjernelse af microbiopsy fra den enhed, som kan påvirke prøve integritet og nyttiggørelse. Selv om at fjerne microbiopsy for RNA udvinding er en effektiv metode, hele proceduren er kedelig, og prøven kan blive udsat for forurening i processen. Ændring af prøve behandling protokol ønskes derfor stærkt for at sikre prøve integritet og forhindre tab af prøven.
Når de ovennævnte to spørgsmål behandles, forventes det, at enheden bliver et standard redskab for klinisk forskning. Det er vigtigt at bemærke, at enheden optager både hud og blodprøve samtidigt og dette bør tages i betragtning, når du analyserer genekspression data. Afslutningsvis, beskriver denne protokol detaljerne i udfører absorberende microbiopsy som en nem og minimalt invasive værktøj til kombineret hud og udtagning af blodprøve og den efterfølgende prøve behandling for relativ gen expression profilering.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne anerkende NHMRC stipendier APP1109749 og APP1111216, University of Queensland Centennial legat og internationale Postgraduate Research Scholarship.
Absorbent microbiopsy fabrication and sampling | |||
Absorbent Microbiopsy | Trajan Scientific and Medical | N/A | https://www.trajanscimed.com/ |
Whatman filter paper, Grade 1 | Sigma Aldrich | WHA1001325 | N/A |
RNA extraction | |||
PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher | KIT0214 | Including all buffer soltuions described in protocol |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher | 10977015 | Improving RNA quality in RNA elution step |
2.0 mL Microcentrifuge Tube, Sterile | Thomas Scientific | 1226S74 | N/A |
Microcentrifuge 5415R | Eppendorf | Z605212 | N/A |
cDNA synthesis | |||
SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline | BIO-65053 | N/A |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | N/A |
qPCR reaction and data analysis | |||
SensiFAST SYBR Lo-ROX Kit | Bioline | BIO-94005 | Including reagents described in qPCR reaction steps |
MicroAmp Optical Adhesive Film | ThermoFisher Scinentific | 4311971 | N/A |
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate | ThermoFisher Scinentific | 4343370 | N/A |
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | ThermoFisher Scinentific | 4485694 | N/A |
GraphPad Prism (v6.04) | GraphPad | N/A; Windows version | Plotting and statistical analysis in qPCR data analysis steps |
PCR primers | |||
RPLP0 F | Sigma Aldrich | N/A | ATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC |
RPLP0 R | Sigma Aldrich | N/A | CAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG |
TYR F | Sigma Aldrich | N/A | TCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA |
TYR R | Sigma Aldrich | N/A | AAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC |
KRT14 F | Sigma Aldrich | N/A | CCT CCT CCC AGT TCT CCT |
KRT14 R | Sigma Aldrich | N/A | ACA CCA CCT TGC CAT CG |
CD3E F | Sigma Aldrich | N/A | CAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG |
CD3E R | Sigma Aldrich | N/A | GTT CTC CAG AGG GTC AGA TG |
CD19 F | Sigma Aldrich | N/A | TTC TGC CTG TGT TCC CTT G |
CD19 R | Sigma Aldrich | N/A | GCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T |