इस अनुच्छेद में, हम प्रदर्शन कैसे शोषक microbiopsy तकनीक का प्रदर्शन किया है और कैसे नमूना त्वचा और एक न्यूनतम इनवेसिव तरीके से खून की सरल और एक साथ नमूने के लिए आरएनए निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
पारंपरिक त्वचा बायोप्सी नैदानिक अनुसंधान है कि cosmetically संवेदनशील क्षेत्रों या बाल चिकित्सा अनुप्रयोगों को अपनी असावधानी के कारण शामिल है सीमाओं । यहाँ, हम एक शोषक microneedle आधारित डिवाइस का उपयोग करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन, microbiopsy अवशोषण, त्वचा और रक्त मिश्रण के न्यूनतम इनवेसिव नमूने के लिए. हमारा लक्ष्य नैदानिक अनुसंधान में तेजी से प्रगति की सुविधा, त्वचा रोग के लिए बायोमार्कर की स्थापना और नैदानिक अनुसंधान प्रतिभागियों के लिए जोखिम को कम करने में मदद करना है । पारंपरिक त्वचा बायोप्सी तकनीकों के विपरीत, शोषक microbiopsy सेकंड के भीतर प्रदर्शन किया जा सकता है और इसकी सरल डिजाइन के कारण गहन प्रशिक्षण की आवश्यकता नहीं है. इस रिपोर्ट में, हम एक स्वयंसेवक पर, लोड हो रहा है और आवेदन सहित शोषक microbiopsy के उपयोग का वर्णन. फिर, हम कैसे अवशोषित नमूना से आरएनए को अलग करने के लिए दिखा । अंत में, हम दोनों रक्त (CD3E और CD19) और त्वचा (KRT14 और tyr) के mrna अभिव्यक्ति स्तरों यों तो करने के लिए मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर (आरटी-qpcr) का उपयोग प्रदर्शित करता है । तरीकों का वर्णन है कि हम बंद शेल्फ किट और अभिकर्मकों का उपयोग । यह प्रोटोकॉल एक ही शोषक microbiopsy मैट्रिक्स के भीतर त्वचा और रक्त के एक साथ नमूने के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव दृष्टिकोण प्रदान करता है. हम मानव नीतिशास्त्र समितियों पाया है, चिकित्सकों और स्वयंसेवकों त्वचा संबंधी अनुसंधान के लिए इस दृष्टिकोण का समर्थन करने के लिए.
त्वचा बायोप्सी त्वचा के नमूने और हिस्टोथोलॉजिकल मूल्यांकन के माध्यम से त्वचा रोगों के बाद के निदान के लिए त्वक् विज्ञान में सबसे आवश्यक तकनीकों में से एक है । बायोप्सी तकनीक परीक्षा1के लिए रोगी की त्वचा पर संदिग्ध घाव को दूर करने के लिए एक ब्लेड या पंच बायोप्सी का उपयोग कर एक चिकित्सा पेशेवर शामिल है । हालांकि तकनीक प्रभावी है, यह उच्च आक्रामक है और अंत बिंदु के रूप में नैदानिक अनुसंधान सीमा आमतौर पर आणविक जीव विज्ञान तकनीकों2,3शामिल है । त्वचा रोगों के आणविक विश्लेषण में अत्यधिक विशिष्ट जैविक जानकारी प्रदान करने की क्षमता होती है जो कि हिस्टोपोथोलॉजिकल विश्लेषण नहीं कर सकता है, इस प्रकार दवा खोज और रोग निदान4,5को सुविधाजनक बनाने में । इसके अलावा, सबसे आणविक तकनीकों में नमूना मांग अपेक्षाकृत छोटी है और पशुओं के उपयोग में कमी करने के लिए नेतृत्व और replicates की एक बड़ी संख्या की अनुमति हो सकती है । इसलिए, एक वैकल्पिक तकनीक के लिए एक स्पष्ट आवश्यकता है जो नैदानिक अनुसंधान में आणविक विश्लेषण को सक्षम बनाती है और प्रतिभागियों के लिए जोखिम को कम करती है ।
क्षेत्र में ऐसी जरूरत को संबोधित करने के लिए, हमारे समूह ने एक उपन्यास microneedle आधारित नैदानिक मंच, शोषक microbiopsy, कि एक सरल और न्यूनतम आक्रामक तरीके से6में रक्त के साथ मिश्रित त्वचा की एक छोटी राशि के संग्रह में सक्षम बनाता है विकसित की है । इस प्रकाशन का उद्देश्य नैदानिक अनुसंधान में आरएनए निष्कर्षण के माध्यम से आणविक विश्लेषण की सुविधा के लिए एक नमूना उपकरण के रूप में शोषक microbiopsy का वर्णन है.
पहले, हम microbiopsy के पहले संस्करण का वर्णन किया है, त्वचा microbiopsy, जो एक microneedle एक तीन परत स्टील प्लेट डिजाइन से बना के होते हैं त्वचा के ऊतकों के छोटे टुकड़े को निकालने के लिए7. इस उपकरण की नवीनता microneedle से कई संपर्क अंक से आता है कि कुशल ऊतक निष्कर्षण3परमिट । इसके विपरीत, एक परिपत्र त्वचा पंच बायोप्सी केवल एक संपर्क बिंदु प्रदान करता है और बस कुछ मामलों में किसी भी नमूने पर कब्जा करने के बिना त्वचा आंसू । त्वचा microbiopsy के आधार पर, हम हाल ही में शोषक microbiopsy जो दोनों रक्त और त्वचा नमूना क्षमताओं है विकसित की है । उपकरण को हाल ही में महामारी विज्ञान अध्ययन6में संसाधन-गरीब क्षेत्रों में उपयोग के लिए व्यवहार्य दिखाया गया है ।
अपनी सरल डिजाइन के कारण, शोषक microbiopsy कुछ ही सेकंड के भीतर प्रदर्शन किया जा सकता है और व्यापक प्रशिक्षण की आवश्यकता नहीं है. इसके अतिरिक्त, स्थानीय संवेदनाहारी की जरूरत नहीं है, और आवेदन साइट scarring कारण नहीं है । वर्तमान प्रोटोकॉल प्रासंगिक नमूना प्रशिक्षण आणविक विश्लेषण के लिए लक्षित त्वचा डेटा प्राप्त करने के लिए बिना शोधकर्ताओं या चिकित्सा पेशेवरों को सक्षम बनाता है । हम microsampling उपकरणों भविष्य में त्वचा अनुसंधान में दिनचर्या बनने की उम्मीद.
हालांकि microbiopsy अन्य त्वचा रोग अध्ययनों में बताया गया है कि आणविक नैदानिक तकनीकों शामिल6,8,9,10, इस तरह के रूप में मानव पैपिलोमा वायरस डीएनए का पता लगाने, इस प्रोटोकॉल पहले नमूना निष्कर्षण और शोषक microbiopsy के लिए प्रसंस्करण तकनीकों का विवरण प्रदर्शित करने के लिए है. इसके अलावा, यह पहली रिपोर्ट है जो माइक्रोबायोप्सी नमूनों में त्वचा और रक्त कोशिकाओं के सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा का वर्णन कर रही है ।
इन परिणामों का प्रदर्शन है कि शोषक microbiopsy सरल और न्यूनतम इनवेसिव आणविक लक्षण वर्णन के लिए त्वचा और रक्त मिश्रण के नमूने के लिए एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. हमारे प्रोटोकॉल के अनुसार डिवाइस आवेदन अन्य आवेदन प्रोटोकॉल (चित्रा 3) के साथ बरामद आरएनए राशि में अंतर से दिखाया गया के रूप में विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है । नमूना निकाले जाने के बाद, rna निष्कर्षण के लिए अनुवर्ती नमूना संसाधन चरण अत्यधिक स्थापित प्रोटोकॉल15,16के समान है । आरएनए निष्कर्षण में प्रारंभिक कदम है कि शोषक microbiopsy के लिए संशोधित कर रहे हैं के अलावा, एक और महत्वपूर्ण परिवर्तन rnase मुक्त पानी का उपयोग करने के लिए बहाव अनुप्रयोगों के लिए परिणामों में सुधार है. इसके अलावा, यह उल्लेख है कि इस अध्ययन में प्रयुक्त संदर्भ जीन RPLP0है लायक है । RPLP0, जिसका समारोह में अच्छी तरह से विभिंन सेल और ऊतक प्रकार के लिए जाना जाता है17, गैर मेलेनोमा त्वचा कैंसर और पूर्ववर्ती घावों18में उपयोग के लिए एक उपयुक्त संदर्भ जीन के रूप में सूचित किया गया है ।
डिवाइस की मुख्य सीमाओं में से एक डिवाइस है, जो समय लेने वाली है और संभावित रूप से rna जैसे संवेदनशील नमूनों के लिए नमूना नुकसान की संभावना बढ़ जाती है से microbiopsy के हटाने है । फिर भी, इस मुद्दे को पूर्व ठंडा करने से दूर किया जा सकता है सभी बाँझ प्रसंस्करण उपकरण, जैसे 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों, सूखी बर्फ पर.
शोषक microbiopsy का उपयोग सरल है और गहन प्रशिक्षण की आवश्यकता नहीं है. पारंपरिक बायोप्सी आवश्यक नहीं है के रूप में microbiopsy जैसे आरटी-qpcr के रूप में स्थापित आणविक निदान तकनीकों के साथ आणविक लक्षणन परमिट. आगे यों तो और शोषक microbiopsy के नमूने की क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए, पिछले साहित्य है कि मानव त्वचा ऊतक से शामिल आरएनए निष्कर्षण की जांच की थी । एक ठेठ ३.० या ४.० मिमी त्वचा पंच बायोप्सी से, तीन अध्ययनों से निकाली गई आरएनए मात्रा से लेकर ५० तक की त्वचा ऊतक के प्रति मिलीग्राम २०० एनजी की सूचना दी है19,20,21. आरएनए के १.४३ एनजी के साथ तुलना करना है कि औसत पर शोषक microbiopsy से बरामद किया गया था (चित्रा 3), नमूना त्वचा ऊतकों का वजन 0.29-115 μg एक ही आरएनए-से-ऊतक अनुपात के आधार पर त्वचा पंच बायोप्सी अध्ययन से सीमा की उंमीद है ।
यह प्रोटोकॉल संभावित नुकसान के बिना नहीं है, हालांकि कुछ समस्याओं को आसानी से दूर किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, आरएनए निष्कर्षण डेटा ने 10-एस होल्डिंग समय (चित्रा 3) के साथ भी काफी भिन्नता का सुझाव दिया । समस्या को हल करने के लिए, एक संभावित समाधान अनुप्रयोग प्रोटोकॉल ऑप्टिमाइज़िंग शामिल है । इस तरह की त्वचा के लिए लागू बल और समय धारण के रूप में मानकों का परीक्षण किया जाना चाहिए और नमूना निष्कर्षण में भिन्नता को कम करने के लिए अनुकूलित. अन्य संभावित मुद्दा नमूना अखंडता और वसूली को प्रभावित हो सकता है, जो डिवाइस से microbiopsy के हटाने है. हालांकि आरएनए निष्कर्षण के लिए microbiopsy हटाने एक प्रभावी दृष्टिकोण है, पूरी प्रक्रिया थकाऊ है, और नमूना प्रक्रिया में संदूषण के संपर्क में हो सकता है । इसलिए, नमूना प्रक्रिया प्रोटोकॉल का संशोधन अत्यधिक नमूना अखंडता को सुनिश्चित करने और नमूना हानि को रोकने के लिए वांछित है ।
एक बार उपरोक्त दो मुद्दों को संबोधित कर रहे हैं, यह डिवाइस नैदानिक अनुसंधान के लिए एक मानक उपकरण बन जाएगा कि उम्मीद है. यह ध्यान रखें कि डिवाइस दोनों त्वचा और रक्त नमूना एक साथ कब्जा करने के लिए महत्वपूर्ण है और यह जीन अभिव्यक्ति डेटा का विश्लेषण करते समय ध्यान में रखा जाना चाहिए. अंत में, इस प्रोटोकॉल संयुक्त त्वचा और रक्त नमूनाकरण और सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति रूपरेखा के लिए बाद में नमूना प्रसंस्करण के लिए एक आसान और न्यूनतम इनवेसिव उपकरण के रूप में शोषक microbiopsy प्रदर्शन के विवरण का वर्णन.
The authors have nothing to disclose.
हम एनएचआरसी फैलोशिप APP1109749 और APP1111216, क्वींसलैंड के विश्वविद्यालय के सौ साल के छात्रवृत्ति और अंतरराष्ट्रीय स्नातकोत्तर अनुसंधान छात्रवृत्ति को स्वीकार करना चाहते हैं ।
Absorbent microbiopsy fabrication and sampling | |||
Absorbent Microbiopsy | Trajan Scientific and Medical | N/A | https://www.trajanscimed.com/ |
Whatman filter paper, Grade 1 | Sigma Aldrich | WHA1001325 | N/A |
RNA extraction | |||
PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher | KIT0214 | Including all buffer soltuions described in protocol |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher | 10977015 | Improving RNA quality in RNA elution step |
2.0 mL Microcentrifuge Tube, Sterile | Thomas Scientific | 1226S74 | N/A |
Microcentrifuge 5415R | Eppendorf | Z605212 | N/A |
cDNA synthesis | |||
SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline | BIO-65053 | N/A |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | N/A |
qPCR reaction and data analysis | |||
SensiFAST SYBR Lo-ROX Kit | Bioline | BIO-94005 | Including reagents described in qPCR reaction steps |
MicroAmp Optical Adhesive Film | ThermoFisher Scinentific | 4311971 | N/A |
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate | ThermoFisher Scinentific | 4343370 | N/A |
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | ThermoFisher Scinentific | 4485694 | N/A |
GraphPad Prism (v6.04) | GraphPad | N/A; Windows version | Plotting and statistical analysis in qPCR data analysis steps |
PCR primers | |||
RPLP0 F | Sigma Aldrich | N/A | ATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC |
RPLP0 R | Sigma Aldrich | N/A | CAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG |
TYR F | Sigma Aldrich | N/A | TCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA |
TYR R | Sigma Aldrich | N/A | AAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC |
KRT14 F | Sigma Aldrich | N/A | CCT CCT CCC AGT TCT CCT |
KRT14 R | Sigma Aldrich | N/A | ACA CCA CCT TGC CAT CG |
CD3E F | Sigma Aldrich | N/A | CAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG |
CD3E R | Sigma Aldrich | N/A | GTT CTC CAG AGG GTC AGA TG |
CD19 F | Sigma Aldrich | N/A | TTC TGC CTG TGT TCC CTT G |
CD19 R | Sigma Aldrich | N/A | GCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T |