이 문서에서는, 흡수 성 microbiopsy 기술을 수행 하는 방법 및 어떻게 샘플에서에서 사용할 수 있습니다 피부와 혈액의 간단 하 고 동시 샘플링에 대 한 RNA 추출에 대 한 최소 침 습 방식으로 보여 줍니다.
기존의 피부 생 검 임상 연구 관련 cosmetically 민감한 부분 또는 그것의 침입으로 인해 소아 응용 프로그램 제한 합니다. 여기, 우리 피부와 혈액 혼합물의 최소 침 습 샘플링에 대 한 흡수 성 미세 바늘 기반 장치, 흡수 성 microbiopsy를 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 목표는 임상 연구, 임상 연구 참가자에 대 한 위험을 감소 하 고 피부 질환에 대 한 생체의 설립에에서 급속 한 진행을 촉진 하는 데 도움이. 기존의 피부 생 검 기술, 달리 흡수 성 microbiopsy 초 이내에 수행할 수 있습니다 그리고 그것의 간단한 설계 집중 훈련을 필요로 하지 않습니다. 이 보고서에서 우리는 흡수 성 microbiopsy, 로드 및 응용 프로그램, 자원 봉사자 등의 사용을 설명 합니다. 다음, 우리는 흡수 샘플에서 RNA를 분리 하는 방법을 보여 줍니다. 마지막으로, 양이 많은 반전 녹음 방송 PCR (RT-정량) mRNA 식 수준 혈액 (CD3E 와 CD19)과 피부 (KRT14 및 TYR)의 척도 사용 하 여를 설명 합니다. 우리가 설명 하는 방법을 선반 장비 및 시 약을 사용 합니다. 이 프로토콜 피부와 같은 흡수 성 microbiopsy 매트릭스 내에서 혈액의 동시 샘플링에 대 한 최소한 침략 적 접근을 제안 한다. 우리는 인간의 윤리 위원회, 임상 및 자원 봉사자가 피부과 연구이 접근의 지지를 발견 했다.
피부 생 검 후속 진단 histopathological 평가 통해 피부 질환 및 피부 샘플링에 대 한 피부과에서 가장 필수적인 기술 중 하나입니다. 생 검 기술은 블레이드 또는 펀치 생 검 검사1에 대 한 환자의 피부에 의심 스러운 병 변 제거를 사용 하 여 의료 전문가 포함 한다. 기술은 효과적 이다, 하지만 매우 침략 적 하 고 끝점은 일반적으로 분자 생물학 기법2,3관련 된 임상 연구를 제한 합니다. 피부 질환의 분자 분석은 histopathological 분석 수 없습니다, 따라서 촉진 약물 발견과 질병 진단4,5매우 특정 생물 학적 정보를 제공할 가능성이 있다. 게다가, 가장 분자 기법에서 샘플 수요는 비교적 작은 수 있습니다 동물 사용에서 감소로 이어질 고 많은 수의 복제를 허용. 따라서, 거기는 명확한 임상 연구에 분자 분석을 가능 하 게 하 고 참가자에 대 한 위험을 낮춘 다는 대체 기술에 대 한 필요.
필드에 이러한 필요를 해결 하기 위해 우리의 그룹 소설 microneedle 기반 진단 플랫폼, 흡수 성 microbiopsy, 피부 간단 하 고 최소 침 습 방식으로6에 피가 섞인의 작은 금액의 수집을 가능 하 게 개발 했다. 이 간행물의 목적은 임상 연구에서 RNA 추출 통해 분자 분석을 촉진 하는 샘플링 도구로 흡수 성 microbiopsy를 설명 하기 위해.
이전에, 우리는 microbiopsy, 피부 조직7의 작은 조각을 추출 하는 3 층 강판 디자인의 미세 바늘으로 구성 되어 피부 microbiopsy의 첫 번째 버전을 설명 했습니다. 이 소자의 참신 효율적인 조직 추출3허용 microneedle에서 여러 접점에서 온다. 반면, 원형 피부 펀치 생 검 단 하나의 접점을 제공 하 고 어떤 경우에 어떤 샘플을 캡처 없이 피부를 단순히 눈물. 피부 microbiopsy을 바탕으로, 우리 최근 흡수 성 microbiopsy 피와 피부 샘플링 기능을 개발 했다. 장치 최근 역학 연구6자원이 부족 한 지역에 사용 하기 위해 실현 되도록 표시 되었습니다.
그것의 간단한 설계, 흡수 성 microbiopsy 몇 초 이내에 수행할 수 있습니다 하 고 광범위 한 훈련을 필요로 하지 않습니다. 또한, 로컬 마 취가 필요 하지 않습니다, 그리고 응용 프로그램 사이트에 흉터가 발생 하지 않습니다. 현재 프로토콜 관련 샘플링 대상된 피부 분자 분석에 대 한 데이터를 얻기 위해 교육 없이 연구원 또는 의료 전문가 수 있습니다. 우리는 피부 연구에 루틴을 미래에 될 microsampling 장치를 기대 합니다.
Microbiopsy는 분자 진단 기술6,,89,10, 인간 유 두 종 바이러스 DNA 탐지,이 프로토콜에 관련 된 다른 피부 질환 연구에 보고 되어 샘플 추출 및 처리 기술을 흡수 성 microbiopsy에 대 한 세부 정보를 설명 하기 위해 처음이 이다. 또한, 이것은 피부 및 microbiopsy 샘플에서 혈액 세포의 상대 진 식 프로 파일링 설명 첫 번째 보고서 이다.
이 결과 분자 특성에 대 한 피부와 혈액 혼합물의 간단 하 고 최소한 침략 적 샘플링에 대 한 흡수 성 microbiopsy 도구로 사용할 수 있습니다 보여줍니다. 우리의 프로토콜에 따라 장치 응용 프로그램은 다른 응용 프로그램 프로토콜 (그림 3)를 사용 하 여 복구할 RNA 금액에 차이 의해와 같이 신뢰할 수 있는 결과 얻기 위해 필수적. 샘플 추출 되 면 RNA 추출에 대 한 단계를 처리 하는 다음 샘플은 설립된 프로토콜15,16와 매우 비슷합니다. 게다가 초기 단계에서 RNA 추출 흡수 성 microbiopsy에 대 한 수정, 또 다른 주요 변화 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 결과 개선 하기 위해 RNase 무료 물의 사용 이다. 또한,이 연구에 사용 된 참조 유전자 RPLP0는 언급 가치가 있다.입니다. RPLP0, 그 함수는 다른 세포와 조직 유형17, 비 흑색 종 피부 암 및 전 암 병 변18에 사용 하기 위해 적합 한 참조 유전자로 보고 되었습니다.
소자의 주요 한계 중 하나는 시간이 많이 걸리는 이며 잠재적으로 샘플 손실, 특히 RNA 같은 민감한 샘플의 기회를 증가 장치에서 microbiopsy의 제거 이다. 그럼에도 불구 하 고, 문제는 미리 2 mL microcentrifuge 튜브 드라이 아이스 등 모든 살 균 처리 도구, 냉각에 의해 극복할 수 있습니다.
흡수 성 microbiopsy 사용 하 여 간단 하 고 집중적인 훈련을 필요로 하지 않습니다. 기존의 생 microbiopsy 허용 설립된 분자 진단 기법, 실시간 정량 Pcr 등 분자 특성으로 필요 하지 않습니다. 추가 계량 하 고 흡수 성 microbiopsy의 샘플링 능력, 인간의 피부 조직에서 RNA 추출 관련 이전 문학 조사 했다. 3 연구 50에서 200에 배열 했다 추출 된 RNA 금액 보고, 전형적인 3.0 또는 4.0 m m 스킨에서 펀치 생 검 피부 조직19,,2021밀리 그램 당 ng. 비교는 1.43 평균 (그림 3), 샘플된 피부 조직의 무게에 흡수 성 microbiopsy에서 복구 된 RNA의 ng 0.29-115에서 범위 것으로 예상 된다 µ g 피부 펀치 생 검 연구에서 동일한 RNA 조직의 비율에 따라.
이 프로토콜은 아니다 잠재적인 함정 없이 문제 들을 쉽게 극복 될 수 있다. 예를 들어 RNA 추출 데이터 10의 보유 시간 (그림 3)와 상당한 변이 제안 했다. 문제를 해결 하려면 하나의 잠재적인 솔루션 응용 프로그램 프로토콜 최적화 포함 됩니다. 힘 등 피부에 적용 하 고 시간 잡고 해야 테스트 하 고 샘플 추출에 변화를 줄이기 위해 최적화. 다른 잠재적인 문제는 샘플 무결성 및 복구에 영향을 줄 수 있는 장치에서 microbiopsy의 제거. 비록 RNA 추출에 대 한 microbiopsy를 제거 하는 것은 효과적인 접근, 전체 절차는 지루한, 그리고 샘플 과정에서 오염에 노출 될 수 있습니다. 따라서, 샘플 처리 프로토콜의 수정 샘플 무결성 보장 및 샘플 손실을 방지 하기 위해 원하는 높은 이다.
위의 두 가지 문제 해결은 일단 장치 임상 연구를 위한 표준 도구가 될 것입니다 예상 된다. 장치는 동시에 피부와 혈액 샘플을 캡처 및이 수 고려 한다 유전자 표현 데이터를 분석할 때 중요 하다. 결론적으로,이 프로토콜 결합 된 피부와 혈액 샘플링 및 상대 진 식 프로 파일링에 대 한 처리 이후 샘플에 대 한 간단 하 고 최소한 침략 적 도구로 흡수 성 microbiopsy을 수행의 세부 사항을 설명 합니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 NHMRC 동호회 APP1109749 및 APP1111216, 퀸즐랜드의 대학 센테니얼 장학금 및 국제 대학원 연구 장학금을 인정 하 고 싶습니다.
Absorbent microbiopsy fabrication and sampling | |||
Absorbent Microbiopsy | Trajan Scientific and Medical | N/A | https://www.trajanscimed.com/ |
Whatman filter paper, Grade 1 | Sigma Aldrich | WHA1001325 | N/A |
RNA extraction | |||
PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher | KIT0214 | Including all buffer soltuions described in protocol |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher | 10977015 | Improving RNA quality in RNA elution step |
2.0 mL Microcentrifuge Tube, Sterile | Thomas Scientific | 1226S74 | N/A |
Microcentrifuge 5415R | Eppendorf | Z605212 | N/A |
cDNA synthesis | |||
SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline | BIO-65053 | N/A |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | N/A |
qPCR reaction and data analysis | |||
SensiFAST SYBR Lo-ROX Kit | Bioline | BIO-94005 | Including reagents described in qPCR reaction steps |
MicroAmp Optical Adhesive Film | ThermoFisher Scinentific | 4311971 | N/A |
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate | ThermoFisher Scinentific | 4343370 | N/A |
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | ThermoFisher Scinentific | 4485694 | N/A |
GraphPad Prism (v6.04) | GraphPad | N/A; Windows version | Plotting and statistical analysis in qPCR data analysis steps |
PCR primers | |||
RPLP0 F | Sigma Aldrich | N/A | ATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC |
RPLP0 R | Sigma Aldrich | N/A | CAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG |
TYR F | Sigma Aldrich | N/A | TCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA |
TYR R | Sigma Aldrich | N/A | AAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC |
KRT14 F | Sigma Aldrich | N/A | CCT CCT CCC AGT TCT CCT |
KRT14 R | Sigma Aldrich | N/A | ACA CCA CCT TGC CAT CG |
CD3E F | Sigma Aldrich | N/A | CAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG |
CD3E R | Sigma Aldrich | N/A | GTT CTC CAG AGG GTC AGA TG |
CD19 F | Sigma Aldrich | N/A | TTC TGC CTG TGT TCC CTT G |
CD19 R | Sigma Aldrich | N/A | GCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T |