I denne artikkelen viser vi hvordan absorberende microbiopsy teknikken er utført og hvordan prøven kan brukes for RNA utvinning for enkel og samtidige prøvetaking av hud og blod i en minimalt invasiv måte.
Konvensjonelle huden biopsi begrenser klinisk forskning som involverer kosmetisk følsomme områder eller pediatric programmer på grunn av sin invasiveness. Her beskriver vi protokollen for å bruke en absorberende microneedle-basert enhet, absorberende microbiopsy, for minimal invasiv utvalg av hud og blod blanding. Vårt mål er å hjelpe lette rask fremgang i klinisk forskning, etablering av biomarkers for huden sykdommen og å redusere risikoen for klinisk forskning deltakere. I motsetning til konvensjonelle huden biopsi teknikker, absorberende microbiopsy kan utføres innen sekunder og krever ikke intensiv trening på grunn av sin enkle design. I denne rapporten beskriver vi bruk av absorberende microbiopsy, inkludert lasting og programmet, på frivillig. Deretter viser vi hvordan du isolerer RNA fra absorbert eksempel. Til slutt, viser vi bruk av kvantitative omvendt transkripsjon PCR (RT-qPCR) å kvantifisere mRNA uttrykk nivåer av både blod (CD3E og CD19) og hud (KRT14 og TYR). Metodene som beskriver vi benytte av sokkelen kits og reagenser. Denne protokollen gir en minimal invasiv tilnærming for samtidige prøvetaking av hud og blod innenfor samme absorberende microbiopsy matrise. Vi har funnet menneskelige komiteer, klinikere og frivillige til å være støttende av denne tilnærmingen til dermatologisk forskning.
Hudbiopsi er en av de viktigste teknikkene i Dermatologi for huden prøvetaking og senere diagnosen hudsykdommer gjennom histopathological vurdering. Biopsi teknikken innebærer en medisinsk faglig bruker en bladet eller punch biopsi fjerne mistenksom lesjonen på pasientens hud for eksamen1. Om teknikken er effektiv, det er svært invasiv og begrenser klinisk forskning som endepunktet innebærer vanligvis molekylærbiologi teknikker2,3. Molekylær analyse av hudsykdommer har potensial til å gi svært spesifikke biologiske informasjon at histopathological analyse kan dermed tilrettelegge drug discovery og sykdom diagnose4,5. Dessuten kan prøve etterspørselen i mest molekylær teknikker er relativt liten og føre til en reduksjon i dyr bruk og tillate et større tall av replikat. Derfor er det et klart behov for en alternativ teknikk som muliggjør molekylær analyse i klinisk forskning og reduserer risikoen for deltakerne.
For å løse slike behov innen, har vår gruppe utviklet en ny microneedle-baserte diagnostiske plattform, absorberende microbiopsy, som muliggjør innsamling av en liten mengde hud blandet med blod i en enkel og minimal invasiv måte6. Formålet med denne publikasjonen er å beskrive den absorberende microbiopsy som et utvalg verktøy for å forenkle molekylær analyse gjennom RNA utvinning i klinisk forskning.
Vi har tidligere beskrevet den første versjonen av microbiopsy, hud microbiopsy, som består av en microneedle laget i en trelags stålplate trekke ut små biter av huden vev7. Nyheten av denne enheten kommer fra flere kontakten poeng fra microneedle som gir effektiv vev utvinning3. Derimot en sirkulær huden punch biopsi gir eneste kontaktpunkt og bare tårer huden uten å fange noen eksempler i noen tilfeller. Basert på huden microbiopsy, utviklet vi nylig av absorberende microbiopsy som har både blod og hud prøvetaking evner. Enheten har vist seg å være mulig for bruk i ressurs-fattig områder i et siste epidemiologisk studie6.
På grunn av sin enkle design, absorberende microbiopsy kan utføres innen få sekunder og krever ikke omfattende opplæring. Dessuten lokalbedøvelse er ikke nødvendig, og programmet nettstedet føre ikke til arrdannelse. Nåværende protokollen gjør at forskere eller medisinske fagfolk uten relevante prøvetaking trening å få målrettede huden data for molekylær analyse. Vi forventer microsampling enheter å bli rutine i huden forskning i fremtiden.
Selv om microbiopsy har blitt rapportert i andre hud sykdom studier som involverte molekylær diagnostiske teknikker6,8,9,10, som Humant papilloma virus DNA oppdagelsen, denne protokollen er først til å vise detaljene for eksempel utvinning og bearbeiding teknikker for den absorberende microbiopsy. Videre, dette er den første rapporten beskriver den relative gene expression profilering av hud og blod celler i microbiopsy prøver.
Disse resultatene viser at den absorberende microbiopsy kan brukes som et verktøy for enkel og minimal invasiv prøvetaking av hud og blod blanding for molekylær karakterisering. Enheten søknaden i henhold til våre protokollen er viktig for å få pålitelige resultater som vist av forskjellen i RNA beløpet med forskjellige programprotokoller (Figur 3). Når prøven er pakket ut, er etterfølgende prøven behandlingstrinn for RNA utvinning svært lik etablerte protokoller15,16. Dessuten fra de første trinnene i RNA utvinning som er endret for den absorberende microbiopsy, er en annen viktig endring bruken av RNase-fritt vann å forbedre resultatene for nedstrøms programmer. Videre er det verdt å nevne at referanse genet brukt i denne studien er RPLP0. RPLP0, hvis funksjon er kjent for ulike celler og vev typer17, har blitt rapportert som et passende referanse gen for bruk i ikke-melanom hudkreft og forstadier lesjoner18.
En av de viktigste begrensningene for enheten er fjerning av microbiopsy fra enheten, som er tidkrevende og potensielt øker sjansen for eksempel tap, særlig for følsom prøver som RNA. Likevel kan problemet overvinnes ved å kjøle før alle sterilt bildebehandling verktøy, for eksempel 2 mL microcentrifuge rør, på tørris.
Bruk av absorberende microbiopsy er enkel og krever ikke intensiv trening. Konvensjonelle biopsi er ikke nødvendig som microbiopsy tillater molekylær karakterisering med etablerte molekylær diagnostisering teknikker, som RT-qPCR. Videre kvantifisere og demonstrere prøvetaking av absorberende microbiopsy, ble tidligere litteratur som involverte RNA utvinning fra menneskelig hud vev undersøkt. Fra en typisk 3.0 eller 4.0 mm hud punch biopsi, tre studier har rapportert utdraget RNA beløpene variert fra 50 til 200 ng per mg huden vev19,20,21. Sammenligne med 1,43 ng av som ble gjenopprettet fra den absorberende microbiopsy i gjennomsnitt (Figur 3), vekten av samplet hudvevet forventes å rekkevidde fra 0.29-115 µg basert på samme RNA-til-vev forholdet fra huden punch biopsi studier.
Denne protokollen er ikke uten potensielle fallgruver, selv om noen av problemene kan være lett overvinnes. For eksempel foreslått RNA utvinning data en betydelig variasjon selv med 10-s holder tiden (Figur 3). For å løse problemet, innebærer en potensiell løsning optimalisere programprotokollen. Parametere som brukes på huden og holder tid skal være testet og optimalisert for å redusere variasjoner i prøven utvinning. Andre potensielle problemet er fjerning av microbiopsy fra enheten, som kan påvirke eksempel integritet og gjenoppretting. Selv om fjerne microbiopsy for RNA utvinning er en effektiv tilnærming, hele prosedyren er kjedelig, og prøven kan bli utsatt for forurensning i prosessen. Endring av prøve behandling protokollen er derfor svært ønsket for å sikre eksempel integritet og forhindre prøve tap.
Når ovennevnte to problemene er adressert, forventes det at enheten vil bli et standardverktøy for klinisk forskning. Det er viktig å merke seg at enheten registrerer både hud og blodprøve samtidig, og dette bør tas i betraktning når du analyserer genuttrykk data. Avslutningsvis beskriver denne protokollen informasjon om utføring av absorberende microbiopsy som en enkel og minimal invasiv verktøy for kombinert hud og blodprøve og påfølgende prøven behandling for relativ gene expression profilering.
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å erkjenne NHMRC stipend APP1109749 og APP1111216, Universitetet i Queensland Centennial stipend og internasjonale Postgraduate forskning stipend.
Absorbent microbiopsy fabrication and sampling | |||
Absorbent Microbiopsy | Trajan Scientific and Medical | N/A | https://www.trajanscimed.com/ |
Whatman filter paper, Grade 1 | Sigma Aldrich | WHA1001325 | N/A |
RNA extraction | |||
PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher | KIT0214 | Including all buffer soltuions described in protocol |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher | 10977015 | Improving RNA quality in RNA elution step |
2.0 mL Microcentrifuge Tube, Sterile | Thomas Scientific | 1226S74 | N/A |
Microcentrifuge 5415R | Eppendorf | Z605212 | N/A |
cDNA synthesis | |||
SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline | BIO-65053 | N/A |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | N/A |
qPCR reaction and data analysis | |||
SensiFAST SYBR Lo-ROX Kit | Bioline | BIO-94005 | Including reagents described in qPCR reaction steps |
MicroAmp Optical Adhesive Film | ThermoFisher Scinentific | 4311971 | N/A |
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate | ThermoFisher Scinentific | 4343370 | N/A |
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | ThermoFisher Scinentific | 4485694 | N/A |
GraphPad Prism (v6.04) | GraphPad | N/A; Windows version | Plotting and statistical analysis in qPCR data analysis steps |
PCR primers | |||
RPLP0 F | Sigma Aldrich | N/A | ATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC |
RPLP0 R | Sigma Aldrich | N/A | CAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG |
TYR F | Sigma Aldrich | N/A | TCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA |
TYR R | Sigma Aldrich | N/A | AAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC |
KRT14 F | Sigma Aldrich | N/A | CCT CCT CCC AGT TCT CCT |
KRT14 R | Sigma Aldrich | N/A | ACA CCA CCT TGC CAT CG |
CD3E F | Sigma Aldrich | N/A | CAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG |
CD3E R | Sigma Aldrich | N/A | GTT CTC CAG AGG GTC AGA TG |
CD19 F | Sigma Aldrich | N/A | TTC TGC CTG TGT TCC CTT G |
CD19 R | Sigma Aldrich | N/A | GCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T |