I den här artikeln visar vi hur absorberande microbiopsy tekniken utförs och hur provet kan användas för RNA-extraktion för enkel och samtidig provtagning för hud och blod på ett minimalt invasivt sätt.
Konventionella hudbiopsi begränsar den kliniska forskning som involverar kosmetiskt känsliga områden eller pediatric applikationer på grund av dess invasivt. Här beskriver vi protokollet för att använda en absorberande microneedle-baserad enhet, absorberande microbiopsy, för minimalt invasiv provtagning av hud och blod blandning. Vårt mål är att bidra till att underlätta snabba framsteg i klinisk forskning, inrättandet av biomarkörer för hudsjukdom och minska risken för klinisk forskning deltagare. I motsats till konventionella huden biopsi tekniker, den absorberande microbiopsy kan utföras inom sekunder och kräver inte intensiv träning på grund av sin enkla design. I den här rapporten beskriver vi användning av absorberande microbiopsy, inbegripet lastning, ansökan och volontär. Sedan visar vi hur man isolera RNA från absorberade provet. Slutligen visar vi användningen av kvantitativa omvänd transkription PCR (RT-qPCR) för att kvantifiera mRNA-uttrycksnivåerna för både blod (CD3E och CD19) och hud (KRT14 och TYR). De metoder som vi beskriver utnyttja off hylla kit och reagenser. Detta protokoll erbjuder en minimalt invasiv metod för samtidig provtagning av hud och blod inom samma absorberande microbiopsy matris. Vi har hittat mänskliga etiska kommittéer, kliniker och frivilliga att vara stödjande av detta tillvägagångssätt för Dermatologisk forskning.
Hudbiopsi är en av de mest grundläggande teknikerna i dermatologi för huden provtagning och efterföljande diagnos av hudsjukdomar genom histopatologisk bedömning. Biopsi tekniken innebär en läkare använder en blade eller punch biopsi ta bort misstänkta lesionen på patientens hud för undersökning1. Även om tekniken är effektiv, det är mycket invasiva och begränsar klinisk forskning som slutpunkten innebär vanligtvis molekylärbiologiska tekniker2,3. Molekylär analys av hudsjukdomar har potential att ge mycket specifik biologisk information att histopatologisk analys kan inte, vilket underlättar drug discovery och sjukdom diagnos4,5. Dessutom kan prov efterfrågan i den molekylära tekniker är jämförelsevis liten och leda till en minskad användning av djur och tillåta ett större antal replikat. Därför finns det ett klart behov för en alternativ teknik som möjliggör molekylär analys i klinisk forskning och sänker risken för deltagarna.
För att lösa sådana behov i fältet, har vår grupp utvecklat en roman microneedle-baserade diagnostiska plattform, absorberande microbiopsy, som möjliggör insamling av en liten mängd hud blandat med blod i en enkel och minimalinvasiv sätt6. Syftet med denna skrift är att beskriva den absorberande microbiopsy som en provtagning verktyg för att underlätta molekylär analys via RNA-extraktion i klinisk forskning.
Tidigare har vi beskrivit den första versionen av microbiopsy, huden microbiopsy, som består av en microneedle gjord av en tre lager stålplåt design att extrahera små bitar av huden vävnader7. Nyhet i enheten kommer från flera kontaktpunkter från den microneedle som tillåter effektiv vävnad utvinning3. Däremot en cirkulär hudbiopsi punch ger endast en kontaktpunkt och helt enkelt tårar huden utan att fånga varje prov i vissa fall. Baserat på den huden microbiopsy, utvecklat vi nyligen den absorberande microbiopsy som har både blod och hud provtagning kapacitet. Enheten har visat sig vara genomförbart för användning i resurssvaga områden i en nyligen epidemiologisk studie6.
På grund av sin enkla design, den absorberande microbiopsy kan utföras inom ett par sekunder och kräver inte omfattande utbildning. Dessutom behövs inte lokalbedövning och appliceringsstället orsakar inte ärrbildning. Detta protokoll kan forskare eller vårdpersonal utan relevant provtagning utbildning att få riktade hud data för molekylär analys. Vi förväntar oss microsampling enheter att bli rutin i huden forskning i framtiden.
Även om microbiopsy har rapporterats i andra studier av hud sjukdom som involverade molekylära diagnosmetoder6,8,9,10, såsom humant papillomvirus DNA upptäckt, detta protokoll är de första att Visa detaljerna i de prov utvinning och bearbetning av teknikerna för den absorberande microbiopsy. Vidare, detta är den första rapporten som beskriver relativa gen uttryck profilering av huden och blodkroppar i microbiopsy prover.
Dessa resultat visar att det absorberande microbiopsy kan användas som ett verktyg för enkel och minimalt invasiv provtagning av hud och blod blandning för molekylär karakterisering. Enheten ansökan i enlighet med våra protokoll är viktigt för att få tillförlitliga resultat som visas av skillnaden i RNA-belopp som återvinns med olika applikationsprotokoll (figur 3). När provet extraheras, är efterföljande provet bearbetningssteg för RNA-extraktion mycket liknande till etablerade protokoll15,16. Förutom från de första stegen i RNA-extraktion som modifieras för den absorberande microbiopsy, är en annan viktig förändring att använda RNase-fritt vatten för att förbättra resultaten för nedströms tillämpningar. Dessutom är det värt att nämna att referensgenen används i denna studie är RPLP0. RPLP0, vars funktion är känt för olika celler och vävnad typer17, har rapporterats som en lämplig referensgenen för användning i icke-melanom hudcancer och precancerösa lesioner18.
En av de viktigaste begränsningarna av enheten är avlägsnande av microbiopsy från enheten, vilket är tidskrävande och potentiellt ökar chansen att prov förlust, speciellt för känslig prover som RNA. Frågan kan dock lösas genom pre-Cooling alla sterila bearbetning verktyg, såsom 2 mL mikrocentrifugrör, på torris.
Användningen av det absorberande microbiopsy är enkel och kräver inte intensiv träning. Konventionella biopsi är inte nödvändig eftersom microbiopsy tillåter molekylär karakterisering med etablerade molekylär diagnos tekniker, såsom RT-qPCR. För att ytterligare kvantifiera och förmåga provtagning av absorberande microbiopsy, undersöktes tidigare litteratur som involverade RNA-extraktion från mänsklig hudvävnad. Från en typisk 3.0 eller 4.0 mm hud punch biopsi, tre studier har rapporterat de extraherade RNA beloppen varierade från 50 till 200 ng per mg hud vävnad19,20,21. Jämföra med 1,43 ng av RNA som återfanns från den absorberande microbiopsy i genomsnitt (figur 3), vikten av samplade huden vävnader väntas ligga från 0,29-115 µg baserat på samma RNA-till-vävnad förhållandet från huden punch biopsi studier.
Detta protokoll är inte utan potentiella fallgropar, men vissa problem kan lösas enkelt. Till exempel föreslog RNA extraktion data en avsevärd variation även med 10 s innehav tiden (figur 3). För att lösa problemet, innebär en potentiell lösning att optimera programprotokoll. Parametrar såsom kraft appliceras på huden och håller tid bör testas och optimeras för att minska variationerna i provet extraktion. Andra potentiella frågan är avlägsnande av microbiopsy från enheten, vilket kan påverka prov integritet och återhämtning. Även om du tar bort microbiopsy för RNA-extraktion är ett effektivt tillvägagångssätt, hela förfarandet är tråkiga, och provet kan exponeras för föroreningar i processen. Ändring av protokollet prov bearbetning önskas därför mycket för att säkerställa urvalet integritet och förhindra förlust av provet.
När ovanstående två frågor behandlas, förväntas det att enheten kommer att bli en standard verktyg för klinisk forskning. Det är viktigt att notera att enheten fångar både hud och blod prov samtidigt och detta bör beaktas när man analyserar gen uttryck data. Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll för att utföra absorberande microbiopsy som ett lätt och minimalt invasiva verktyg för kombinerad hud och blodprovstagning och efterföljande provet bearbetning för relativa gen uttryck profilering.
The authors have nothing to disclose.
Vi skulle vilja erkänna NHMRC stipendier APP1109749 och APP1111216, University of Queensland Centennial stipendium och internationella forskarutbildning forskning Scholarship.
Absorbent microbiopsy fabrication and sampling | |||
Absorbent Microbiopsy | Trajan Scientific and Medical | N/A | https://www.trajanscimed.com/ |
Whatman filter paper, Grade 1 | Sigma Aldrich | WHA1001325 | N/A |
RNA extraction | |||
PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher | KIT0214 | Including all buffer soltuions described in protocol |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher | 10977015 | Improving RNA quality in RNA elution step |
2.0 mL Microcentrifuge Tube, Sterile | Thomas Scientific | 1226S74 | N/A |
Microcentrifuge 5415R | Eppendorf | Z605212 | N/A |
cDNA synthesis | |||
SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline | BIO-65053 | N/A |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | N/A |
qPCR reaction and data analysis | |||
SensiFAST SYBR Lo-ROX Kit | Bioline | BIO-94005 | Including reagents described in qPCR reaction steps |
MicroAmp Optical Adhesive Film | ThermoFisher Scinentific | 4311971 | N/A |
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate | ThermoFisher Scinentific | 4343370 | N/A |
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | ThermoFisher Scinentific | 4485694 | N/A |
GraphPad Prism (v6.04) | GraphPad | N/A; Windows version | Plotting and statistical analysis in qPCR data analysis steps |
PCR primers | |||
RPLP0 F | Sigma Aldrich | N/A | ATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC |
RPLP0 R | Sigma Aldrich | N/A | CAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG |
TYR F | Sigma Aldrich | N/A | TCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA |
TYR R | Sigma Aldrich | N/A | AAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC |
KRT14 F | Sigma Aldrich | N/A | CCT CCT CCC AGT TCT CCT |
KRT14 R | Sigma Aldrich | N/A | ACA CCA CCT TGC CAT CG |
CD3E F | Sigma Aldrich | N/A | CAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG |
CD3E R | Sigma Aldrich | N/A | GTT CTC CAG AGG GTC AGA TG |
CD19 F | Sigma Aldrich | N/A | TTC TGC CTG TGT TCC CTT G |
CD19 R | Sigma Aldrich | N/A | GCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T |