Bu makalede, biz emici microbiopsy tekniği nasıl yapılır ve nasıl örnek için RNA çıkarma basit ve aynı zamanda yapılan örnekleme için-deri ve kan minimal invaziv bir şekilde kullanılabileceğini göstermektedir.
Geleneksel cilt biyopsisi kozmetik hassas alanlarda veya onun invasiveness nedeniyle Pediatrik uygulamaları ile ilgili klinik araştırma sınırlar. Burada, bir emici microneedle tabanlı aygıt, emici microbiopsy, deri ve kan karışımı minimal invaziv örnekleme için kullanma Protokolü açıklar. Amacımız hızlı ilerleme klinik araştırma, cilt hastalıkları ve klinik araştırma katılımcılar için riski azaltmak için biyolojik kurulması kolaylaştırmak yardımcı olmaktır. Geleneksel cilt biyopsisi teknikleri, aksine emici microbiopsy saniye içinde gerçekleştirilebilir ve yoğun bir eğitim ile basit tasarımı gerektirmez. Bu raporda, emici microbiopsy yükleme ve uygulama, bir gönüllü de dahil olmak üzere, nasıl kullanılacağını açıklar. O zaman, biz RNA absorbe örnekten yalıtmak nasıl göstereceğim. Son olarak, nicel ters transkripsiyon PCR (RT-qPCR) kan (CD3E ve CD19) ve (KRT14 ve TYR) deri mRNA ifade düzeylerini ölçmek için kullanımını göstermektedir. Biz tarif yöntemleri raf kitleri ve Kimyasalları kullanmak. Bu iletişim kuralı için deri ve kan aynı emici microbiopsy matris içinde eşzamanlı örnekleme minimal invaziv bir yaklaşım sunmaktadır. Biz insan etik komiteler, klinisyenler ve gönüllü dermatolojik araştırma için bu yaklaşımın destek olmaya bulduk.
Cilt biyopsisi Dermatoloji deri örnekleme için en temel teknikleri ve sonraki tanı histopatolojik değerlendirmesi ile cilt hastalıkları biridir. Biyopsi tekniği bir sağlık uzmanına muayene1için hastanın cilt şüpheli lezyon kaldırmak için bir bıçak veya punch biyopsi kullanarak içerir. Teknik etkili olsa da, son derece invaziv ve bitiş noktası genellikle moleküler biyoloji teknikleri2,3karıştırmak gibi klinik araştırma sınırlar. Moleküler analiz cilt hastalıkları histopatolojik analizi, böylece ilaç bulma ve hastalık tanı4,5kolaylaştırmak yapamam çok özel biyolojik bilgi sağlamak için potansiyele sahiptir. Ayrıca, örnek talep en moleküler teknikleri nispeten küçük ve hayvan kullanımı bir azalma kurşun ve çoğaltır daha çok sayıda izin. Bu nedenle, ortada açık bir klinik araştırma moleküler analiz sağlar ve katılımcılar için risk düşürür alternatif bir tekniği için gerekir.
Böyle bir ihtiyaç alanındaki adrese, bizim grup geliştirmiştir bir roman microneedle tabanlı tanı platformu, basit ve minimal invazif şekilde6kanla karışık cilt küçük bir miktar koleksiyonu sağlayan emici microbiopsy. Bu yayının amacı emici microbiopsy moleküler analizi RNA ayıklama klinik araştırma ile kolaylaştırmak için bir örnekleme araç olarak tarif etmektir.
Daha önce microbiopsy, Cilt dokular7küçük parçalar ayıklamak için bir üç kat sac tasarım yapılan bir microneedle oluşur deri microbiopsy ilk sürümü anlatmıştık. Yenilik bu cihazın verimli doku çıkarma3izni microneedle birden çok kişi puan gelir. Buna ek olarak, dairesel deri punch biyopsi tek bir irtibat noktası sağlar ve bazı durumlarda herhangi bir örnek yakalama olmadan cilt sadece gözyaşları. Cilt microbiopsy dayanarak, biz son zamanlarda geliştirilen kan ve deri yetenekleri örnekleme olan emici microbiopsy. Cihazın son epidemiyolojik çalışma6kaynak-yoksul bölgelerde uygulanabilir olduğu gösterilmiştir.
İle basit tasarımı, emici microbiopsy bir kaç saniye içinde gerçekleştirilebilir ve kapsamlı bir eğitim gerektirmez. Ayrıca, lokal anestezik gerekli değildir ve uygulama sitesi skarlasma neden olmaz. Araştırmacılar veya tıp uzmanları ilgili örnekleme moleküler analiz için hedeflenen cilt verileri elde etmek için eğitim olmadan sağlayan mevcut protokol. Microsampling cihazlar deri araştırma yordamında gelecekte olmak için bekliyoruz.
Her ne kadar microbiopsy moleküler tanı teknikleri6,8,9,10, insan papilloma virüsü DNA tespiti, bu iletişim kuralı gibi dahil diğer cilt hastalığı çalışmalarda bildirilmiştir emici microbiopsy örnek çıkarma ve işleme teknikleri ayrıntılarını göstermek için ilk olduğunu. Ayrıca, bu açıklayan göreli gen ifade deri ve kan hücreleri microbiopsy örneklerinde profilleme ilk rapordur.
Bu sonuçlar emici microbiopsy basit ve minimal invaziv örnekleme moleküler karakterizasyonu için deri ve kan karışımı için bir araç olarak kullanılabilir gösterilmektedir. Aygıt kullanma bizim protokol uyarınca farklı uygulama protokolleri (şekil 3) ile kurtarılan RNA tutar farkı tarafından gösterildiği gibi güvenilir sonuçlar elde etmek için esastır. Bir kez örnek hulâsa, RNA çıkarılması için adım işleme sonraki örnek kurulan iletişim kuralları15,16‘ son derece benzerdir. Ayrıca emici microbiopsy için değiştirilmiş ilk adımda RNA ayıklama, başka bir anahtar değişimi RNase free su aşağı akım uygulamaları için sonuçlarını iyileştirmek için kullanılır. Ayrıca, bu çalışmada kullanılan referans gen RPLP0olduğunu kayda değer olduğunu. Kimin işlevi farklı hücre ve doku türleri17için bilinen, RPLP0, Melanom olmayan deri kanserlerinin ve prekanseröz lezyonlar18kullanmak için uygun başvuru gen olarak bildirilmiştir.
Bir aygıtın ana sınırlamaları microbiopsy zaman alır ve potansiyel olarak özellikle RNA gibi hassas örnekleri için örnek kaybı olasılığı artar olan aygıt üzerinden çıkartılmasıdır. Yine de, sorunun tüm steril işlenme aleti, Kuru buz üzerine 2 mL microcentrifuge boruları gibi ön soğutma tarafından üstesinden gelebilir.
Emici microbiopsy kullanımı basittir ve yoğun bir eğitim gerektirmez. Geleneksel biyopsi microbiopsy RT-qPCR gibi kurulan moleküler tanı yöntemleri ile moleküler karakterizasyonu izni olmaksızın gerekli değildir. Daha fazla ölçmek ve emici microbiopsy örnekleme yeteneğini göstermek için RNA çekme–dan insan deri dokusu dahil önceki edebiyat araştırılmıştır. Tipik 3.0 veya 4.0 mm dış görünümden biyopsi yumruk, üç çalışmalar 50’den 200’e değişiyordu ayıklanan RNA tutarları bildirdin ng cilt doku19,20,21mg başına. 1.43 ile karşılaştırarak ng emici microbiopsy ortalama (şekil 3), örneklenen cilt dokularının ağırlığını kurtarıldı RNA’ın 0,29-115 aralığı için beklenen µg cilt punch biyopsi çalışmalar aynı RNA doku oranına dayalı.
Bazı sorunları kolayca üstesinden gelebilir bu protokolü potansiyel tuzaklar değildir. Örneğin, RNA ayıklama veri önemli farklılıklar bile 10-s holding zamanla (şekil 3) önerdi. Bu sorunu çözmek için uygulama protokolü en iyi duruma getirme bir olası çözüm içerir. Parametreleri gücü gibi cilde uygulanan ve test olmalıdır zaman holding ve örnek çıkarma değişimler azaltmak için en iyi duruma getirilmiş. Diğer olası bir sorunu microbiopsy örnek bütünlüğü ve kurtarma etkisi olabilir cihaz, çıkartılmasıdır. Microbiopsy RNA çıkarılması için kaldırma etkili bir yaklaşım olmakla birlikte, yordamın tamamını sıkıcı ve örnek kirlenme sürecinde maruz. Bu nedenle, örnek işlem protokolü değişiklik son derece örnek bütünlüğünü ve örnek kaybını önlemek için arzu edilir.
Yukarıdaki iki konular ele sonra bu cihazın klinik araştırma için standart bir araç haline bekleniyor. Cihazın deri ve kan örneği aynı anda yakalar ve bu dikkate gen ifadesi verileri çözümlerken alınması gereken unutmamak gerekir. Sonuç olarak, bu iletişim kuralı olarak birleştirilmiş deri ve kan örnekleme ve göreli gen ifade profil oluşturma için işleme sonraki örnek için kolay ve minimal invaziv bir araçtır emici microbiopsy gerçekleştirmeyi ayrıntılarını açıklar.
The authors have nothing to disclose.
NHMRC Arkadaş grupları APP1109749 ve APP1111216, Queensland Üniversitesi kuruluşunun yüzüncü yılını kutlayan burs ve uluslararası yüksek lisans araştırma bursu kabul etmek istiyoruz.
Absorbent microbiopsy fabrication and sampling | |||
Absorbent Microbiopsy | Trajan Scientific and Medical | N/A | https://www.trajanscimed.com/ |
Whatman filter paper, Grade 1 | Sigma Aldrich | WHA1001325 | N/A |
RNA extraction | |||
PicoPure RNA Isolation Kit | ThermoFisher | KIT0214 | Including all buffer soltuions described in protocol |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher | 10977015 | Improving RNA quality in RNA elution step |
2.0 mL Microcentrifuge Tube, Sterile | Thomas Scientific | 1226S74 | N/A |
Microcentrifuge 5415R | Eppendorf | Z605212 | N/A |
cDNA synthesis | |||
SensiFAST cDNA Synthesis Kit | Bioline | BIO-65053 | N/A |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | N/A |
qPCR reaction and data analysis | |||
SensiFAST SYBR Lo-ROX Kit | Bioline | BIO-94005 | Including reagents described in qPCR reaction steps |
MicroAmp Optical Adhesive Film | ThermoFisher Scinentific | 4311971 | N/A |
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate | ThermoFisher Scinentific | 4343370 | N/A |
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | ThermoFisher Scinentific | 4485694 | N/A |
GraphPad Prism (v6.04) | GraphPad | N/A; Windows version | Plotting and statistical analysis in qPCR data analysis steps |
PCR primers | |||
RPLP0 F | Sigma Aldrich | N/A | ATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC |
RPLP0 R | Sigma Aldrich | N/A | CAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG |
TYR F | Sigma Aldrich | N/A | TCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA |
TYR R | Sigma Aldrich | N/A | AAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC |
KRT14 F | Sigma Aldrich | N/A | CCT CCT CCC AGT TCT CCT |
KRT14 R | Sigma Aldrich | N/A | ACA CCA CCT TGC CAT CG |
CD3E F | Sigma Aldrich | N/A | CAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG |
CD3E R | Sigma Aldrich | N/A | GTT CTC CAG AGG GTC AGA TG |
CD19 F | Sigma Aldrich | N/A | TTC TGC CTG TGT TCC CTT G |
CD19 R | Sigma Aldrich | N/A | GCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T |