Upptäckt av en cirkulerande mikroRNA anpassad Panel hos patienter med metastaserad kolorektal Cancer
Summary
Vi presenterar ett protokoll för att utvärdera uttrycksnivåerna av cirkulerande mikroRNA (Mirna) i plasmaprover från cancerpatienter. I synnerhet använde vi ett kommersiellt tillgängliga kit för cirkulerande miRNA utvinning och omvänd transkription. Slutligen, analyserade vi en panel med 24 utvalda microRNA använder realtid pre fläckig sonden anpassade plattor.
Abstract
Det ökar intresset för flytande biopsi för diagnos, prognos och terapeutisk övervakning, skapar behovet av tillförlitliga och användbara biomarkörer för klinisk praxis. Här presenterar vi ett protokoll extrakt, omvänd transkribera och utvärdera uttrycksnivåerna av cirkulerande microRNA från plasmaprover av patienter med kolorektal cancer (CRC). mikroRNA (Mirna) är en klass av icke-kodande RNAs 18-25 nukleotider i längd som reglerar uttrycket av målgener på translationell nivå och spela en viktig roll, bland annat av pro – och anti-angiogena funktion, i Fysiopatologi av olika organ. microRNA är stabila i biologiska vätskor såsom serum och plasma, vilket gör dem idealiska cirkulerande biomarkörer för cancer diagnos, prognos och behandling beslutsfattande och övervakning. Cirkulerande miRNA extraktionen utfördes med hjälp av en snabb och effektiv metod som innefattar både ekologisk och kolumn-baserade metoder. För miRNA retrotranscription använde vi en multi-steg-procedur som anser polyadenylation på 3′ och ligering av en adapter på 5′ av den mogna microRNA, följt av slumpmässiga miRNA före förstärkning. Vi valde en 24-miRNA anpassad panel ska testas av kvantitativ realtids polymeras-kedjereaktion (qRT-PCR) och fläckig miRNA sonderna på array anpassade plattor. Vi genomförde qRT-PCR plate körs på en realtids PCR-System. Städning microRNA för normalisering valdes använder GeNorm programvara (v. 3.2). Data analyserades med hjälp av uttrycket suite-programvara (v 1.1) och statistiska analyser utfördes. Metoden visade sig vara tillförlitliga och tekniskt robust och kan vara användbart att utvärdera biomarkör nivåer i flytande prov såsom plasma eller serum.
Introduction
CRC representerar tredje vanligaste diagnosen malignitet och den fjärde orsaken till cancerrelaterad död i världen. Hittills har har bevacizumab (B), en monoklonal antikropp riktad mot vascular-endotel tillväxtfaktor (VEGF), och (C) cetuximab eller panitumumab (P), monoklonala antikroppar riktade mot epidermal tillväxtfaktor (EGFR), godkänts för första linjens behandling i kombination med kemoterapi (CT) regimer.
Mutationer i K-RAS – och N-RAS gener är de enda kliniskt användbara biomarkörer kan identifiera patienter som är minst benägna att dra nytta av anti-EGFR-baserade CT. Även om flera studier har genomförts för att söka efter biomarkörer som är prediktiva för svar till B-baserade CT, finns det fortfarande en betydande brist på tillförlitliga och effektiva läkemedel för användning i klinisk praxis1.
microRNA är små RNAs (18-25 nukleotider i längd) som reglerar översättningen av målgener och spelar en avgörande roll i många physiopathological processer, inklusive embryogenes och karcinogenicitet. Dessa molekyler är mycket stabil i biologiska vätskor såsom plasma/serum, urin och slem, som gör dem robusta biomarkörer för att använda för icke-invasiv provtagning2. Med hjälp av en panel av microRNA involverade i angiogena väg, vi syftade till att identifiera nya cirkulerande biomarkörer kan förutsäga kliniskt utfall hos patienter med metastatisk CRC (mCRC) behandlas med en B-baserad CT regim.
Vi analyserade en rad 52 mCRC-patienter som behandlas med B-baserade CT inom den prospektiv multicenter randomiserad fas III-prövning ”italienska rättegång i avancerad kolorektalcancer” (ITACa). Detta protokoll godkändes av den lokala etiska kommittén (Comitato Etico området Vasta e Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, nr 674) på 19: e September 2007. Alla patienter gav informerat samtycke innan blod provsamling. För varje patient, venöst blodprover samlades in före behandling och vid den första kliniska utvärderingen (efter 8 veckor) för att utvärdera baslinjen miRNA uttryck och dess modulering under behandling i förhållande till patientens resultatet.
Genom att söka på litteraturen, vi valt 21 microRNA korrelerade med angiogena processen som är kända för att kunna upptäckas i human plasma: har-miR-107, har-miR-126-3 p, har-miR-145-5 p, har-miR-194-5 p, har-miR-199a – 5p, har-miR-200b – 3p, har-miR-20b – 5p , har-miR-21-5 p, har-miR-210-3 p, har-miR-221-3 p, har-miR-24-3 p, har-miR-27a – 3p, har-miR-29b – 3p, har-miR-335-5 p, har-miR-424-5 p, har-miR-497-5 p, har-miR – 520d – 3p, har-miR-92a – 3p, har-miR-17-5 p och har-miR-155-5 p. Vi valde också har-miR-223-3 p och har-mir-484 för endogena normalisering3,4,5,6, och cel-miR-39 renas från C. elegans som ett spike för exogena normalisering. Alla data normalizations utfördes med hjälp av metoden 2 ̂ ̄(ΔΔCt).
Påvisande av cirkulerande microRNA presenterar några tekniska svårigheter eftersom molekylerna befinner sig på mycket låga nivåer i plasma och deras förstärkning är kemiskt utmanande med tanke på deras kort sekvens. Av dessa skäl har valt vi ett förfarande som anser både organiska extraktion med fenol och en glas-fiber kolumnbaserade metod. Cirkulerande miRNA utvinning är ett hett ämne i fältet av flytande biopsi, och vi valde ett kommersiella kit som har visat sig vara en av de mest tillförlitliga när det gäller mängden och kvaliteten på återvunna avkastning7,8. Vi valde ett protokoll till omvänd transkribera microRNA genom tillägg av en adapter 5′ och en poly(A) svans till 3′ av den mogna miRNA att förbättra fiskeredskapens selektivitet och specificitet av reaktionen.
Robustheten av metoden, vi utformade anpassade plattor med pre fläckig sonder för RT-PCR att bedöma varje prov i två exemplar och analyseras 2 patienter inom varje platta, som visas i figur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
microRNA är små icke-kodande RNAs (18-25 nukleotider i längd) kan bindande regionen 3′ UTR i deras mål messenger RNA och hämmande eller förnedrande det. De kan alltså anses gene expression tillsynsmyndigheter på translationell nivå. Under det senaste decenniet, har flera microRNA korrelerats med cancer initiering och utveckling, vilket gör dem användbara kliniska biomarkörer för diagnostik, prognos och behandling. Skyddas av Rnaser, är microRNA närvarande i en stabil form i biologiska vätskor såsom blod,…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie finansierades delvis av Roche S.p.A. och den italienska läkemedel byrån (AIFA).
Materials
| Rnase-free Safe-lock 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| Rnase-free Safe-lock 2 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.344 | |
| Rnase-free 20 µL tips | Starlab | S1123-1810 | |
| Rnase-free 200 µL tips | Starlab | S1120-8810 | |
| Rnase-free 1000 µL tips | Starlab | S1122-1830 | |
| mirVana PARIS RNA and Native Protein Purification Kit | Thermo Fisher | AM1556 | |
| TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher | A28007 | |
| 100% ethanol anidrous ACS grade | Carlo Erba Reagents | 414605 | |
| 2-mercapto-ethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher | 4444558 | |
| TaqMan Advanced miRNA Assays | Thermo Fisher | A25576 | |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4406984 | |
| 0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 µL laboratory pipettes | |||
| Benchtop microcentrifuge | |||
| Vortex | |||
| Benchtop heating block | |||
| Fume hood | |||
| 0.2 mL PCR tubes |
Riferimenti
- Luo, H. -. Y., Xu, R. -. H. Predictive and prognostic biomarkers with therapeutic targets in advanced colorectal cancer. World journal of gastroenterology. 20 (14), 3858-3874 (2014).
- Toiyama, Y., Okugawa, Y., Fleshman, J., Richard, C., Goel, A. MicroRNAs as potential liquid biopsy biomarkers in colorectal Cancer: A systematic review. BBA Reviews on Cancer. 5 (6), (2018).
- Kok, M. G. M., Halliani, A., Moerland, P. D., Meijers, J. C. M., Creemers, E. E., Pinto-Sietsma, S. J. Normalization panels for the reliable quantification of circulating microRNAs by RT-qPCR. FASEB Journal. 29 (9), 3853-3862 (2015).
- Marabita, F., De Candia, P., Torri, A., Tegnér, J., Abrignani, S., Rossi, R. L. Normalization of circulating microRNA expression data obtained by quantitative real-time RT-PCR. Briefings in Bioinformatics. 17 (2), 204-212 (2016).
- Danese, E., et al. Reference miRNAs for colorectal cancer: Analysis and verification of current data. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
- Zheng, G., et al. Identification and validation of reference genes for qPCR detection of serum microRNAs in colorectal adenocarcinoma patients. PLoS ONE. 8 (12), 1-10 (2013).
- Lv, W., et al. Optimization of the Original TRIzol-Based Technique Improves the Extraction of Circulating MicroRNA from Serum Samples. Clinical laboratory. 61 (12), 1953-1960 (2015).
- Tan, G. W., Khoo, A. S. B., Tan, L. P. Evaluation of extraction kits and RT-qPCR systems adapted to high-throughput platform for circulating miRNAs. Scientific reports. 5, 9430 (2015).
- Altman, D. G., McShane, L. M., Sauerbrei, W., Taube, S. E. Reporting Recommendations for Tumor Marker Prognostic Studies (REMARK): explanation and elaboration. PLoS medicine. 9 (5), (2012).
- Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods (San Diego, Calif). 50 (4), 298-301 (2010).
- Cheng, H. H., et al. Plasma Processing Conditions Substantially Influence Circulating microRNA Biomarker Levels. PLoS ONE. 8 (6), 1-11 (2013).
- Moret, I., et al. Assessing an improved protocol for plasma microRNA extraction. PloS one. 8 (12), (2013).
- Khoury, S., Ajuyah, P., Tran, N. Isolation of small noncoding RNAs from human serum). Journal of visualized experiments JoVE. (88), e51443 (2014).
- Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 11 (3), 145-156 (2014).
