효모의 4D 현미경 검사법
Summary
이 프로토콜은 다중 색상 4D (타임 랩스 3D) 공초점 현미경을 사용하여 신진 효모에서 형광 표지 된 세포 내 구획의 분석을 설명합니다. 이미징 매개 변수는 광손상을 제한하면서 적절한 신호를 캡처하도록 선택됩니다. 사용자 정의 ImageJ 플러그인은 레이블이 지정된 구조를 추적하고 정량적으로 분석할 수 있도록 합니다.
Abstract
이 프로토콜의 목표는 막 구획이 신진 효모의 살아있는 세포에서 어떻게 형성되고 변형되는지 특성화하는 것입니다. 효모에 있는 많은 세포내 구획은 역동적이고, 그들의 속성의 완전한 이해는 시간 경과 화상 진찰을 요구합니다. 다색 4D 공초점 형광 현미경 검사법은 5-15 분의 시간 척도로 세포 내 구획의 동작과 구성을 추적하는 강력한 방법입니다. 섹션. 이를 위해 매우 낮은 레이저 전력으로 빠르게 스캔하여 광표백 및 광독성을 최소화하고 픽셀 크기와 Z-스텝 간격을 최대 해상도로 이미지 샘플링과 호환되는 가장 큰 값으로 설정합니다. 결과 4D 데이터 세트는 시끄러우지만 데컨볼루션으로 평활할 수 있습니다. 높은 품질의 데이터를 가지고 있더라도 세포내 구조는 종종 수,이질성 및 이동이 기때문에 분석 단계는 도전적입니다. 이러한 요구를 충족하기 위해 사용자 지정 ImageJ 플러그인은 컴퓨터 화면의 4D 데이터를 배열하고, 관심 있는 구조를 식별하고, 개별 구조를 격리하기 위해 데이터를 편집하고, 형광 시간 과정을 정량화하고, 투영된 Z 스택의 동영상을 만들기 위해 작성되었습니다. 4D 동영상은 안정적인 구획과 성숙에 의해 뒤집어발생하는 일시적인 구획을 구별하는 데 특히 유용합니다. 이러한 영화는 또한 구획 융합과 같은 이벤트를 특성화하고 특정 돌연변이 또는 다른 섭동의 효과를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
endomembrane 시스템의 구획은 일정한 유속에 있고, 그들의 전체 특성은 살아있는 세포 화상 진찰을 요구합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 4D(time-lapse 3D) 공초점 현미경을 사용하여 신진 효모에서 형광으로 표지된 구획을 시각화하는 프로토콜입니다. 이 방법은 피키아 목회와 사카로마이세스 세레비시아1,2,3의분비구의 역학을 추적하기 위해 개발되었다. 이 프로토콜은 개별 시스터네이가 광학적으로 해결할 수있는 비 스택 골지가있는 S. cerevisiae에 초점을 맞춥니다4. S. cerevisiae에 있는 특이한 Golgi 조직은 4D 현미경 검사법에 의하여 Golgi cisterna가 처음에 상주 초기 골지 단백질로 레이블을 붙였다는 것을 가능하게 하고, 그 때 상주 늦은 Golgi 단백질을 취득하는 동안 그 단백질을 분실합니다3 ,5. 이러한 전이가 초기 골지 단백질 Vrg4가 GFP로 표지되는 균주를 생성하고 후기 골지 단백질 Sec7은 단모료 적색 형광 단백질로 표지되는 균주를 생성함으로써 시각화될 수 있다. 개별 시스테르네이가 추적되면 성숙도가 녹색에서 빨간색으로 변환3으로 관찰됩니다. 이러한 유형의 분석은 단백질 국소화 및 구획 정체성에 대한 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다. 예를 들어, 도착 및 출발 시간을 약간 상쇄하는 두 개의 단백질이 정적 이미지의 다른 구획에 레이블을 지정하는것처럼 보일 수 있지만 4D 영화에서 동일한 구획에 동일한 구획에 레이블을 지정하는 것을 볼 수 있습니다 6,7 . 따라서, 4D 현미경 검사법은 그렇지 않으면 분명하지 않을 현상을 제시합니다.
효모 구획의 유익한 4D 현미경 검사법은 적절한 절차와장비 2로 달성 될 수 있습니다. 가능하면 형광 단백질 태깅은 과발현 아티팩트를 피하기 위해 유전자 교체 8에 의해 수행됩니다. 세포 내 구조는 종종 매우 동적이기 때문에 시간이 지남에 따라 구조를 안정적으로 추적하기 위해 4D 이미징이 필요합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 고감도 검출기가 장착된 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용합니다. 이 장치를 사용하면 S. cerevisiae의 전체 세포 부피는 거의 1-3 초마다 공초점 현미경 검사법에 의해 이미지화 될 수 있으며 2 s 간격이 일반적입니다. 형광단의 라벨링 밀도와 광물리성질에 따라 최대 5-15분 동안 데이터를 수집할 수 있습니다. 주요 장애물은 사진 표백을 최소화하는 것입니다. 이를 위해, 레이저 강도는 가능한 한 낮게 유지되고, 공초점 스캔 속도가 최대화되고, 광학 파라미터는 과도한 광 노출을 피하면서 관련 정보를 캡처하기 위해 나이퀴스트 한계에서 이미지화하도록 구성된다. 이러한 설정은 또한 광독성을 완화시킬 것으로 예상되며, 이는라이브 셀 이미징 9,10,11동안 종종 간과되는 요인이다. 그 결과 시끄러운 데이터는 표백제 보정 및 데콘볼루션 알고리즘으로 처리되어 형광 강도의 정량화를 용이하게 합니다.
고품질 4D 영화를 사용할 때도 효모 구획이 많고 이기종적이며 이동이 많기 때문에 분석이 까다롭습니다. 공초점 현미경 검사법의 본질적인 한계와 장기간 4D 이미징에 필요한 비최적의 설정으로 인해 서로 가까이 있는 형광 구조는 해결하기 가 어렵습니다. 이 문제는 라벨링 기간 동안 광학적으로 해결할 수 있는 소수의 형광 구조물에 초점을 맞추어 이러한 구조가 표지된 전체 집단을 대표한다는 가정하에 우회할 수 있습니다. 구획. 안정적으로 추적할 수 있는 형광구는 투영된 Z 스택의 동영상을 보고 각 시점의 광학 섹션이 컴퓨터 화면에 배열되는 일련의 몽타주를 생성하여 식별됩니다. 이 분석은 개별 구조를 격리하여 추적 할 수 있도록 사용자 정의 ImageJ12 플러그인을 사용합니다.
최근 방법 논문은 효모 세포의 4D 공초점 화상 진찰의 이론 그리고 사례 뿐만 아니라 효모13에 있는 형광성 단백질의 사용을 다루었습니다2. 이 프로토콜은 4D 이미징 실험의 주요 실용적인 측면에 중점을 둡니다. 여기에는 앞에서 설명한 절차에 대한 몇 가지 향상된 기능과 ImageJ 플러그인 코드 및 설명서의 업데이트된 버전이 포함되어 있습니다. 표시된 예는 Golgi 역학에 초점을 맞추고 있지만이 프로토콜은 다른 효모 구획을 이미징하는 데 똑같이 적합합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
효모 세포기관의 4D 공초점 이미징은 여러 매개 변수를 주의 깊게 조정해야 합니다. 주요 관심사는 광표백 및 광독성입니다. 일반적인 4D 영화는 수천 개의 광학 섹션을 수집하는 것을 포함하므로 레이저 조명을 가능한 한 낮게 유지해야 합니다. 탠덤 형광 단백질 태그는 태그된단백질(16,17)의발현을 증가시키지 않고 신호를 증진하는데 사용될 수 있다. ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH 교부금 R01 GM104010에 의해 지원되었다. NIH 가 지원하는 암 센터 지원 교부금 P30 CA014599에 의해 지원되는 통합 현미경 코어 시설에서 비타스 빈도카스와 크리스틴 Labno에 형광 현미경 검사법에 대한 지원을 주셔서 감사합니다.
Materials
| 35 mm glass bottom dishes No. 1.5 | MatTek | P35G-0.170-14-C | Imaging dishes |
| Concanavalin A powder | Sigma-Aldrich | C2010 | |
| Trolox | Vector Laboratories | CB-1000 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Huygens Essential software, version 17.04 | Scientific Volume Imaging | Deconvolution software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software |
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