JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioingegneria

قياس ديناميات حساسة لقوة البروتين في الخلايا الحية باستخدام مزيج من التقنيات الفلورسنت

Published: November 02, 2018
doi:
10.3791/58619
, ,
1Department of Biomedical Engineering,Duke University

Summary

هنا، فإننا نقدم بروتوكول للاستخدام المتزامن لصدى فورستر الطاقة التوتر القائم على نقل أجهزة استشعار لقياس البروتين الأسفار وتحميل الانتعاش بعد فوتوبليتشينج لقياس ديناميات البروتين مما يتيح قياس حساسة للقوة ديناميات البروتين داخل الخلايا الحية.

Abstract

خلايا الإحساس والاستجابة للرموز المادية في البيئة الخاصة بهم عن طريق تحويل المنبهات الميكانيكية إلى إشارات قابلة للاكتشاف المتحلل في عملية تسمى ميتشانوترانسدوكشن. خطوة حاسمة في ميتشانوترانسدوكشن هو انتقال القوات بين البيئتين الداخلية والخارجية. لنقل القوات، ويجب أن تكون هناك صلة مادية مستمرة ومتواصلة تم إنشاؤها بواسطة سلسلة من تفاعلات البروتين البروتين. تفاعلاً بروتين-بروتين معين، تحميل الميكانيكية يمكن أن يكون أما أي تأثير على التفاعل، وتؤدي إلى عدم اقتران أسرع من التفاعل، أو حتى تستقر التفاعل. فهم كيف الجزيئية تحميل يملي دوران البروتين في الخلايا الحية يمكن أن توفر معلومات قيمة حول الحالة الميكانيكية للبروتين، بدوره في توضيح دورها في ميتشانوترانسدوكتيون. تفتقر إلى قياسات مباشرة لتحميل البروتين التقنيات الموجودة لقياس ديناميات البروتين المراعية للقوة أو الاعتماد على القياسات يؤديها خارج سياق الخلوية. هنا، نحن وصف بروتوكول لاسترداد fluorescence نقل الطاقة الرنين فورستر بعد تقنية فوتوبليتشينج (اربط الحنق)، التي تمكن من قياس ديناميات حساسة لقوة البروتين داخل الخلايا الحية. هذه التقنية التي يمكن تطبيقها على أي جهاز استشعار التوتر القائم على الحنق، تيسير دراسة ديناميات البروتين المراعية للقوة في مجموعة متنوعة من الهياكل سوبسيلولار وفي أنواع مختلفة من الخلايا.

Introduction

البيئة خارج الخلية هو مصدرا غنيا للإشارات البيوكيميائية والجسدي على السواء التي تملي سلوك الخلية. على وجه الخصوص، يمكن التوسط الطبيعة الفيزيائية المكروية الوظائف الخلوية الرئيسية، بما في ذلك نمو الخلايا، والهجرة، وتمايز1،2،،من34. التقلبات وميكانيكا المكروية هو عنصر حاسم للعديد من الأمراض التي لم تقم حتى الآن مثل السرطان5،6من تصلب الشرايين وتليف7العلاج الكافي. فهم كامل لكيفية تحويل الخلايا المحفزات المادية إلى إشارات قابلة للاكتشاف المتحلل، عملية تسمى ميتشانوترانسدوكتيون، ويتطلب الكشف عن الآليات الجزيئية بوساطة قوة الإرسال، سواء داخل وخارج الخلايا و داخل هياكل سوبسيلولار متعددة.

داخل هياكل سوبسيلولار والبروتينات يتحولون باستمرار؛ ملزمة وكائنة على أساس قوة تفاعلاتها مع ربط الشركاء8. للقوات بنجاح إرسالها عبر مسافة مادية، يجب أن يكون هناك سلسلة تفاعلات البروتين البروتين، مما يعني أن دوران للبروتين يجب أن تكون بطيئة ما يكفي لإدامة وإرسال قوة إلى شريك ملزم9غير منقطعة. بينما تفاعلات البروتين البروتين عموما تتكون من عدة غير تساهمية سندات بين المجالات البروتين، غالباً ما يتم تصور التفاعل كدولة منضمة يمكن الانتقال إلى حالة غير منضم تحت ظروف مختلفة10، 11-لوجود تفاعل بروتين-بروتين معين، فمن الممكن أن القوة يمكن أن يكون أي تأثير على عمر التفاعل، المعروف في “سندات مثالية”، وتقليل مدة التفاعل، المعروفة باسم “سند زلة”، أو زيادة عمر التفاعل ، المعروف باسم “سند قبض”10. ومن ثم، هناك علاقة معقدة بين ديناميات البروتين، الذي نشير إليه بوصفه ديناميات القوة الحساسة وتحميل البروتين.

نحو فهم تأثير الحمل على ديناميات بوند، تم إجراء عدد من التجارب الزاخرة على مستوى جزيء واحد. استخدام البروتينات المعزولة، أو أجزاء من البروتينات وتقنيات التلاعب مثل ملاقط مغناطيسية وملاقط بصرية ومجهر القوة الذرية، أثبتت هذه الدراسات تفاعلات البروتين البروتين المراعية للقوة لعدة ذات الصلة البروتينات11،12. كلا إينتيجرينس13 وكادهيرينس14، التي بروتينات transmembrane هام لتشكيل خلية خلية والخلية-مصفوفة التفاعلات، على التوالي، قد أثبتت التعديلات في ديناميات الواجب لتحميل. داخل الخلية، يتم تجنيده لكلا تالين15 و α-كاتينين16 بطريقة تعتمد على قوة فينكولين ويمكن تشكيل رابطة صيد مع الأكتين17، مشيراً إلى دور حاسم فينكولين في الالتصاقات المحورية (فاس) وتقاطعات أدهيرينس (عيس ) تحت تحميل. دراسات جزيء واحد تسمح لعزل تفاعلات البروتين البروتين محددة ويسفر عن نتائج لا لبس فيها، ولكن أنها لا تراعي الطابع المعقد للبيئة الخلوية.

التجارب التاريخية أظهرت أن العديد من الهياكل سوبسيلولار، بما في ذلك منظمة تضامن النساء الأفريقيات وعيس، ميتشانوسينسيتيفي، ومعرض الجمعية تعزيز استجابة للأحمال المولدة داخليا أو خارجياً تطبيقها18،19، 20،،من2122. بالإضافة إلى ذلك، اقترح عدة نماذج نظرية أن الجمعية ميتشانوسينسيتيفي يمكن أن يكون مدفوعا بروتين القوة الحساسة ديناميات23،،من2425. لفحص هذه الديناميات المراعية للقوة داخل الخلايا الحية، اتخذت النهج غير المباشرة قليلة. فراب والتقنيات ذات الصلة توفر منهجية بسيطة نسبيا لقياس ديناميات البروتين في خلايا26،27،،من2829. ومع ذلك، قد قياس البروتين تحميل أكثر محدودية. نهج نموذجي مقارنة ديناميات البروتين في الخلايا مع أو بدون التعرض مثبط سيتوسكيليتال المستخدمة للحد عموما خلية contractility،8،،من3031. وهذا من الناحية المفاهيمية، مقارنة بين تحميل عالي والدوله تحميل منخفض. ومع ذلك، هناك لا التحديد الكمي للتحميل عبر البروتين في أي دولة، وقد تكون هناك آثار غير مقصودة البيوكيميائية للمانع، هذه خسارة مواقع الربط الرئيسية على طول خيوط أكتين و. نهج آخر، خاصة بفاس، تم قياس مجموع قوة كشفه على الركيزة باستخدام مجهر القوة الجر التقريبي التحميل الجزيئية ودراسة العلاقة مع القوى المحركة للبروتين وحيد داخل اتحاد كرة القدم32اتحاد كرة القدم. في حين يسمح هذا النهج للتحديد الكمي لمجموع القوة، أنه لا يقدم معلومات محددة جزيئيا. منظمة تضامن النساء الأفريقيات تتكون من البروتينات المختلفة ما يزيد على 200، وكثير منها يمكن أن تحمل حمولة33. وهكذا، قياس ناتج مجموع القوة FA يحتمل أن يحجب إمكانية مسارات انتقال القوة متعددة ولا توفر مقياسا لتحميل موثوق على بروتين معين.

خلافا للنهج السابق في ميتشانوبيولوجي، ظهور أجهزة استشعار التوتر القائم على الحنق يسمح مباشرة قياس الأحمال التي تعانيها بروتينات محددة داخل الحية الخلايا34،،من3536. نقدم هنا، بروتوكول الذي يجمع بين أجهزة استشعار التوتر القائم على الحنق مع التدبير القائم على فراب لديناميات البروتين. ونشير إلى هذا الأسلوب اربط الحنق. ويمكن هذا النهج المتزامن قياس حمولة البروتين وديناميات البروتين، مما يتيح تقييم ديناميات حساسة لقوة البروتين في الخلايا الحية (الشكل 1). بالفعل، طبق تقنية اربط الحنق على دراسة ديناميات القوة الحساسة فينكولين بروتين رابط الميكانيكية37. وقد وضعت أجهزة استشعار التوتر للعديد من البروتينات ذات الصلة في مجموعة متنوعة من الهياكل سوبسيلولار. على سبيل المثال، وضعت أجهزة الاستشعار فينكولين34 وتالين38،39 في فاس، وكادهيرينس، وكاتينينس في عيس40،،من4142، نيسبرين في اللغوي النووية المعقدة 43و α-أكتينين44 و فيلامين36 في سيتوسكيليتون، و MUC-1 في جليكوكاليكس45، بين أمور أخرى46. وبالمثل، فراب وقد استخدمت تقنية شائعة استخدام في البروتينات ميتشانوسينسيتيفي داخل الالتصاقات التنسيق8،31و تقاطعات أدهيرينس47، أكتين اللحاء26، ونواة48. ووضع أجهزة الاستشعار، والسماح للقياسات لديناميات القوة الحساسة في مجموعة متنوعة من السياقات وهياكل سوبسيلولار المضي قدما، ينبغي أن يكون الأسلوب اربط الحنق نطاق واسع ينطبق على أي من هذه المجسات الموجودة أو حديثا. تحقيقا لهذه الغاية، نحن نقدم بروتوكول مفصلاً، والمعمم لتنفيذ الأسلوب اربط الحنق المطبقة في هذه النظم المختلفة. ونأمل أن هذا سيمكن مجموعة متنوعة واسعة من التجارب توضيح أدوار مختلف البروتينات ميتشانوسينسيتيفي في تنظيم انتقال القوة وفي التوسط في سلوك الخلية.

Protocol

1-توليد عينات لتصوير التوتر ثابت صريح في نوع الخلايا المطلوب بناء أجهزة الاستشعار. استنساخ بناء جهاز استشعار التوتر إلى ناقل برل أو بلازميد التعبير الفيروسية الأخرى.ملاحظة: تتوفر العديد من أدوات الاستنساخ الجزيئي مختلفة لتحقيق هذه الخطوة بما في ذلك استخدام إنزيمات التقييد، و?…

Representative Results

بكى–فراب تتكون من المزيج من اثنين من التقنيات الفلورسنت، وتآكل وفراب. كما ركزنا على آثار الحمل البروتين، استخدمنا التوتر القائم على الحنق مجسات34،46. أجهزة الاستشعار هذه كثيرا ما تستند إلى توتر الاستشعار عن الوحدة تتألف من اثنين من البروتي…

Discussion

يسمح أسلوب اربط الحنق للقياس المباشر لديناميات بروتين القوة الحساسة، خاصية التي كان من الصعب لمباشرة التحقيق داخل الخلايا الحية. حساسية البروتين ديناميات لتحميل الجزيئية أمر حاسم لوظيفة البروتين كقوة جهاز الإرسال أو محول الطاقة. تحميل مطلوب لنقل المولدة داخليا على حد سواء وقوات تطبيق خ?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيده هذا العمل جائزة “المهنة مؤسسة العلوم الوطنية” (NSF-CMMI-14-54257) فضلا عن المنح المقدمة من جمعية القلب الأمريكية (16GRNT30930019)، والمعاهد الوطنية للصحة (R01GM121739-01) منحت للدكتور عبدالله حسين هوفمان ووطنية العلوم مؤسسة الدراسات العليا البحوث منحة “الزمالة” إلى روثنبرغ كاترين. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية لجبهة الخلاص الوطني أو المعاهد الوطنية للصحة.

Materials

0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25300062
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 30525-89-4
60x Objective NA1.35 Olympus UPLSAPO 60XO
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) Gibco 15240-062
Automated Stage Prior Scientific H117EIX3
Custom Dichroic Mirror Chroma Technology Corp T450/514rpc
Custom mTFP1 Emission Filter Chroma Technology Corp ET485/20m
Custom mTFP1 Excitation Filter Chroma Technology Corp ET450/30x
Custom Venus Excitation Filter Chroma Technology Corp ET514/10x
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium Sapphire MC102
Dulbecco's Modified Eagle's Medium  Sigma Aldrich D5796 with L-glutamine and sodium bicarbonate
Fetal Bovine Serum HyClone SH30396.03
Fibronectin, Human Corning 47743-654
FRAPPA Calibration Slide Andor provided along with FRAPPA unit
FRAPPA System with 515 nm Laser Andor
Glass-bottomed Fluoro Dishes World Precision Instruments FD35
HEK293-T Cells ATCC CRL-3216
Hexadimethrine Bromide, Polybrene Sigma Aldrich H9268-5G
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma Aldrich D6429
Inverted Fluorescent Microscope Olympus IX83
JMP Pro Software SAS
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels Sutter Instruments LB10-NW
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb Sutter Instruments LS/OF30
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027
MATLAB Software Mathworks
MEM Non-Essential Amino Acids Thermo Fisher 11140050
MetaMorph for Olympus Olympus
Micro-Humidification System Bioptechs 130708
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter Beckman Coulter B25982
Objective Heater Medium Bioptechs 150819-13
OptiMEM Thermo Fisher 31985070
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537
pMD2.G Envelope Plasmid Addgene 12259
pRRL Vector gift from Dr. Kam Leong (Columbia University)
psPax2 Packaging Plasmid Addgene 12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera Hamamatsu Photonics C11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge Thermo Fisher 75004505
Stable Z Stage Warmer Bioptechs 403-1926
Venus Emission Filter Semrock FF01-571/72
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (5), 308-319 (2011).
  2. Mammoto, T., Ingber, D. E. Mechanical control of tissue and organ development. Development. 137 (9), 1407-1420 (2010).
  3. Sun, Y., Chen, C. S., Fu, J. Forcing stem cells to behave: a biophysical perspective of the cellular microenvironment. Annual Review of Biophysics. 41, 519-542 (2012).
  4. Wozniak, M. A., Chen, C. S. Mechanotransduction in development: a growing role for contractility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (1), 34-43 (2009).
  5. Broders-Bondon, F., Nguyen Ho-Bouldoires, T. H., Fernandez-Sanchez, M. E., Farge, E. Mechanotransduction in tumor progression: The dark side of the force. The Journal of cell biology. 217 (5), 1571-1587 (2018).
  6. Simmons, R. D., Kumar, S., Jo, H. The role of endothelial mechanosensitive genes in atherosclerosis and omics approaches. Archives of Biochemistry and Biophysics. 591, 111-131 (2016).
  7. Wells, R. G. Tissue mechanics and fibrosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (7), 884-890 (2013).
  8. Lele, T. P., et al. Mechanical forces alter zyxin unbinding kinetics within focal adhesions of living cells. Journal of Cellular Physiology. 207 (1), 187-194 (2006).
  9. Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475 (7356), 316-323 (2011).
  10. Dembo, M., Torney, D. C., Saxman, K., Hammer, D. The reaction-limited kinetics of membrane-to-surface adhesion and detachment. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 234 (1274), 55-83 (1988).
  11. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. Molecular-Scale Tools for Studying Mechanotransduction. Annual Review of Biomedical Engineering. 17, 287-316 (2015).
  12. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  13. Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand. The Journal of Cell Biology. 185 (7), 1275-1284 (2009).
  14. Rakshit, S., Zhang, Y., Manibog, K., Shafraz, O., Sivasankar, S. Ideal catch, and slip bonds in cadherin adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (46), 18815-18820 (2012).
  15. del Rio, A., et al. Stretching Single Talin Rod Molecules Activates Vinculin Binding. Science. 323 (5914), 638-641 (2009).
  16. Seddiki, R., et al. Force-dependent binding of vinculin to alpha-catenin regulates cell-cell contact stability and collective cell behavior. Molecular Biology of the Cell. 29 (4), 380-388 (2018).
  17. Huang, D. L., Bax, N. A., Buckley, C. D., Weis, W. I., Dunn, A. R. Vinculin forms a directionally asymmetric catch bond with F-actin. Science. 357 (6352), 703-706 (2017).
  18. Chrzanowska-Wodnicka, M., Burridge, K. Rho-stimulated contractility drives the formation of stress fibers and focal adhesions. The Journal of Cell Biology. 133 (6), 1403-1415 (1996).
  19. Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
  20. Liu, Z., et al. Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions. Proceedings of the National Academy of Science. 107 (22), 9944-9949 (2010).
  21. Riveline, D., et al. Focal contacts as mechanosensors: externally applied local mechanical force induces growth of focal contacts by an mDia1-dependent and ROCK-independent mechanism. The Journal of Cell Biology. 153 (6), 1175-1186 (2001).
  22. Brevier, J., Vallade, M., Riveline, D. Force-extension relationship of cell-cell contacts. Physical Review Letters. 98 (26), 268101 (2007).
  23. Bershadsky, A., Kozlov, M., Geiger, B. Adhesion-mediated mechanosensitivity: a time to experiment, and a time to theorize. Current opinion in cell biology. 18 (5), 472-481 (2006).
  24. Chan, C. E., Odde, D. J. Traction dynamics of filopodia on compliant substrates. Science. 322 (5908), 1687-1691 (2008).
  25. Wu, Z., Plotnikov, S. V., Moalim, A. Y., Waterman, C. M., Liu, J. Two distinct actin networks mediate traction oscillations to confer focal adhesion mechanosensing. Biophysical Journal. 112 (4), 780-794 (2017).
  26. Fritzsche, M., Charras, G. Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching. Nature Protocols. 10 (5), 660-680 (2015).
  27. McNally, J. G. Quantitative FRAP in analysis of molecular binding dynamics in vivo. Methods of Cell Biology. 85, 329-351 (2008).
  28. Wehrle-Haller, B. Analysis of integrin dynamics by fluorescence recovery after photobleaching. Methods in Molecular Biology. 370, 173-202 (2007).
  29. Carisey, A., Stroud, M., Tsang, R., Ballestrem, C. Fluorescence recovery after photobleaching. Methods of Molecular Biology. 769, 387-402 (2011).
  30. Carisey, A., et al. Vinculin regulates the recruitment and release of core focal adhesion proteins in a force-dependent manner. Current Biology. 23 (4), 271-281 (2013).
  31. Wolfenson, H., Bershadsky, A., Henis, Y. I., Geiger, B. Actomyosin-generated tension controls the molecular kinetics of focal adhesions. Journal of Cell Science. 124, 1425-1432 (2011).
  32. Dumbauld, D. W., et al. How vinculin regulates force transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (24), 9788-9793 (2013).
  33. Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma’ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. Functional atlas of the integrin adhesome. Nature Cell Biology. 9 (8), 858-867 (2007).
  34. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  35. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Biophysical Methods in Cell Biology. 125, 161-186 (2015).
  36. Meng, F., Suchyna, T. M., Sachs, F. A fluorescence energy transfer-based mechanical stress sensor for specific proteins in situ. The FEBS Journal. 275 (12), 3072-3087 (2008).
  37. Rothenberg, K. E., Scott, D. W., Christoforou, N., Hoffman, B. D. Vinculin Force-Sensitive Dynamics at Focal Adhesions Enable Effective Directed Cell Migration. Biophysical journal. 114 (7), 1680-1694 (2018).
  38. Austen, K., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nature Cell Biology. 17 (12), 1597-1606 (2015).
  39. Kumar, A., et al. Talin tension sensor reveals novel features of focal adhesion force transmission and mechanosensitivity. The Journal of Cell Biology. 213 (3), 371-383 (2016).
  40. Acharya, B. R., et al. Mammalian Diaphanous 1 Mediates a Pathway for E-cadherin to Stabilize Epithelial Barriers through Junctional Contractility. Cell Reports. 18 (12), 2854-2867 (2017).
  41. Borghi, N., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (31), 12568-12573 (2012).
  42. Conway, D. E., Williams, M. R., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Endothelial cell responses to atheroprone flow are driven by two separate flow components: low time-average shear stress and fluid flow reversal. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), H367-H374 (2010).
  43. Arsenovic, P. T., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).
  44. Ye, N., et al. Direct observation of alpha-actinin tension and recruitment at focal adhesions during contact growth. Experimental Cell Research. 327 (1), 57-67 (2014).
  45. Paszek, M. J., et al. The cancer glycocalyx mechanically primes integrin-mediated growth and survival. Nature. 511 (7509), 319-325 (2014).
  46. Gayrard, C., Borghi, N. FRET-based Molecular Tension Microscopy. Methods. 94, 33-42 (2016).
  47. de Beco, S., Gueudry, C., Amblard, F., Coscoy, S. Endocytosis is required for E-cadherin redistribution at mature adherens junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (17), 7010-7015 (2009).
  48. Östlund, C., et al. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. Journal of Cell Science. 122 (22), 4099-4108 (2009).
  49. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. . The interactions of retroviruses and their hosts. , (1997).
  50. Komatsubara, A. T., Matsuda, M., Aoki, K. Quantitative analysis of recombination between YFP and CFP genes of FRET biosensors introduced by lentiviral or retroviral gene transfer). Scientific Reports. 5, 13283 (2015).
  51. Nasri, M., Karimi, A., Farsani, M. A. Production purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes. Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).
  52. . Generating Stable Cell Lines with Lentivirus Available from: https://www.addgene.org/protocols/generating-stable-cell-lines (2016)
  53. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 45 (3), 194-205 (2001).
  54. Malkani, N., Schmid, J. A. Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One. 6 (4), e18586 (2011).
  55. Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical journal. 91 (5), L39-L41 (2006).
  56. Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (3), 364-382 (2015).
  57. Carnell, M., Macmillan, A., Whan, R. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP): acquisition, analysis, and applications. Methods of Molecular Biology. 1232, 255-271 (2015).
  58. Trembecka, D. O., Kuzak, M., Dobrucki, J. W. Conditions for using FRAP as a quantitative technique–influence of the bleaching protocol. Cytometry A. 77 (4), 366-370 (2010).
  59. Lavelin, I., et al. Differential effect of actomyosin relaxation on the dynamic properties of focal adhesion proteins. PLoS One. 8 (9), e73549 (2013).
  60. Foote, H. P., Sumigray, K. D., Lechler, T. FRAP analysis reveals stabilization of adhesion structures in the epidermis compared to cultured keratinocytes. PLoS One. 8 (8), e71491 (2013).
  61. Zal, T., Gascoigne, N. R. Photobleaching-corrected FRET efficiency imaging of live cells. Biophysical Journal. 86 (6), 3923-3939 (2004).
  62. Hodgson, L., Shen, F., Hahn, K. Biosensors for characterizing the dynamics of rho family GTPases in living cells. Current Protocols in Cell Biology. 46 (1), (2010).
  63. Day, R. N. Measuring protein interactions using Förster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods. 66 (2), 200-207 (2014).
  64. Rapsomaniki, M. A., et al. easyFRAP: an interactive, easy-to-use tool for qualitative and quantitative analysis of FRAP data. Bioinformatics. 28 (13), 1800-1801 (2012).
  65. Zamir, E., et al. Molecular diversity of cell-matrix adhesions. Journal of cell science. 112 (11), 1655-1669 (1999).
  66. Bakolitsa, C., et al. Structural basis for vinculin activation at sites of cell adhesion. Nature. 430 (6999), 583-586 (2004).
  67. De Los Santos, C., Chang, C. W., Mycek, M. A., Cardullo, R. FRAP, FLIM, and FRET: Detection and analysis of cellular dynamics on a molecular scale using fluorescence microscopy. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 587-604 (2015).
  68. Periasamy, A., Wallrabe, H., Chen, Y., Barroso, M. Chapter 22: Quantitation of protein-protein interactions: confocal FRET microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 569-598 (2008).
  69. Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
  70. Zeug, A., Woehler, A., Neher, E., Ponimaskin, E. G. Quantitative intensity-based FRET approaches–a comparative snapshot. Biophysical Journal. 103 (9), 1821-1827 (2012).
  71. Ehrlicher, A. J., Nakamura, F., Hartwig, J. H., Weitz, D. A., Stossel, T. P. Mechanical strain in actin networks regulates FilGAP and integrin binding to filamin A. Nature. 478 (7368), 260-263 (2011).
  72. Guo, B., Guilford, W. H. Mechanics of actomyosin bonds in different nucleotide states are tuned to muscle contraction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (26), 9844-9849 (2006).
  73. Lee, C. Y., et al. Actin depolymerization under force is governed by lysine 113:glutamic acid 195-mediated catch-slip bonds. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (13), 5022-5027 (2013).
  74. Cost, A. L., Ringer, P., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. How to Measure Molecular Forces in Cells: A Guide to Evaluating Genetically-Encoded FRET-Based Tension Sensors. Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (1), 96-105 (2015).
  75. Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nature Cell Biology. 19 (1), 28-37 (2017).
  76. Case, L. B., et al. Molecular mechanism of vinculin activation and nanoscale spatial organization in focal adhesions. Nature Cell Biology. 17 (7), 880-892 (2015).
  77. Chen, H., Cohen, D. M., Choudhury, D. M., Kioka, N., Craig, S. W. Spatial distribution and functional significance of activated vinculin in living cells. The Journal of Cell Biology. 169 (3), 459-470 (2005).
  78. Kim, T. J., et al. Dynamic visualization of alpha-catenin reveals rapid, reversible conformation switching between tension states. Current Biology. 25 (2), 218-224 (2015).
  79. Yao, M., et al. Mechanical activation of vinculin binding to talin locks talin in an unfolded conformation. Scientific reports. 4, 4610 (2014).

Tags

Force-sensitive Protein DynamicsFluorescent TechniquesMechanobiologyVinculinTalinCadherinsNesprinTension Sensor ConstructFibronectinFRAP LaserAcceptor FluorophoreMechanically-sensitive ProteinsCell-cell InteractionsCell-environment InteractionsMolecular ScaleLiving Cells
check_url/it/58619?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Rothenberg, K. E., Puranam, I., Hoffman, B. D. Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques. J. Vis. Exp. (141), e58619, doi:10.3791/58619 (2018).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image