살아있는 세포 형광 기술의 조합을 사용 하 여 힘에 민감한 단백질 역학의 측정

Summary

여기, 선물이 포스터 공명의 동시 사용에 대 한 프로토콜 에너지 전송 기반 긴장 센서 측정 단백질 역학 힘 민감한 측정을 사용 하는 photobleaching 후 단백질 부하 및 형광 복구를 측정 하 살아있는 세포 내 단백질 역학입니다.

Abstract

셀 감지 하 고 mechanotransduction를 호출 하는 과정에서 화학적 감지 신호에 기계적 자극을 변환 하 여 그들의 환경에서 실제 신호에 응답. Mechanotransduction에 중요 한 단계는 외부와 내부 환경 사이 힘의 전송 이다. 전송 세력, 지속적인된 끊어지지 물리적 결합 단백질-단백질 상호 작용의 일련에 의해 생성 되어야 합니다. 주어진된 단백질-단백질 상호 작용에 대 한 기계적 부하 중 상호 작용에 아무런 영향을 가질 수 있습니다, 그리고 상호 작용의 더 빠른 분열에 또는 안정화 상호 작용. 살아있는 세포에 있는 단백질 회전율 차례로 elucidating mechanotransduction에서의 역할, 단백질의 기계적 상태에 대 한 유용한 정보를 제공할 수 있습니다 지시 어떻게 분자 부하를 이해 한다. 힘에 민감한 단백질 역학을 측정 하기 위한 기존의 기술 단백질 부하의 직접 측정을 부족 하거나 세포 컨텍스트 외부에서 수행 하는 측정에 의존 합니다. 여기, 우리는 photobleaching (무서 워 졸라) 기술, 살아있는 세포 내에서 힘에 민감한 단백질 역학의 측정을 가능 하 게 후 포스터 공명 에너지 전송 형광 복구에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 기술은 잠재적으로 다양 한 subcellular 구조와 다른 세포 유형 힘에 민감한 단백질 역학의 연구를 촉진 어떤 긴장 무서 워 기반 센서에 적용 됩니다.

Introduction

세포 외 셀 동작을 지정 하는 생 화 학적 및 물리적 단서의 풍부한 원천입니다. 특히,는 microenvironment의 물리적 특성 키 세포 기능, 세포 성장, 감 별 법^1,2,3,4, 마이그레이션, 등 중재 수 있습니다. microenvironment의 역학의 Dysregulation 아직 없는 암⁵, 아 테 롬⁶, 섬유 증⁷등 적절 한 치료는 많은 질병에 중요 한 구성 요소입니다. 세포 화학적 감지 신호에 물리적 자극을 변환 하는 방법의 완벽 한 이해, 프로세스 mechanotransduction 되 나, 필요 힘 전송, 모두에 세포에서 중재 하는 분자 메커니즘의 해명 및 내 여러 subcellular 구조.

Subcellular 구조, 내부 단백질은 지속적으로 선회; 바인딩 고 강도 바인딩 파트너⁸와 그들의 상호 작용에 따라 바인딩. 물리적 거리에 걸쳐 성공적으로 전송 될 세력 단백질 단백질 상호 작용, 단백질의 매출 유지 하 고 그것의 바인딩 파트너⁹힘을 전송 하는 속도가 느린 해야 의미의 파손 되지 않는 사슬 해야 합니다. 상호 작용 다른 조건^10, 에서 언바운드 상태로 전환 수 바인딩된 상태로 종종 개념 동안 단백질 단백질 상호 작용은 일반적으로의 여러 비-공유 결합 사이 단백질 도메인 구성, ¹¹. 주어진된 단백질-단백질 상호 작용을 위해 힘 “이상적인 본드” 라고 하는 상호 작용의 수명에 영향을, “슬립 본드” 라고 하는 상호 작용의 수명을 감소 또는 상호 작용의 수명을 늘릴 수는 가능 하다 “캐치 본드”¹⁰로 알려진. 따라서, 단백질 로드와 힘 민감한 역학 지칭 단백질 역동성 사이 복잡 한 관계가 이다.

채권 역학에 부하의 영향을 이해, 향해 매우 유익한 실험의 수 단일 분자 수준에서 수행 되었습니다. 고립 된 단백질, 또는 단백질 및 조작 기술이 자기 핀셋, 광학 핀셋, 원자 힘 현미경 검사 법의 파편을 사용 하 여,이 학문은 설명 했다 힘에 민감한 단백질 단백질 상호 작용에 관련 단백질^11,12. 두 integrins¹³ 및 cadherins¹⁴이 막 횡단 단백질 형성 세포-매트릭스와 세포 세포 상호 작용, 각각에 대 한 중요 한, 역학 때문에 변경 로드 설명 했다. 셀 내에, vinculin 힘 종속 방식에서 모두 중부¹⁵ 와 α-catenin¹⁶ 보충 하 고 말라¹⁷, 초점 유착 (FAs)와 외화 접합 (AJs에서 vinculin에 대 한 중요 한 역할을 나타내는 캐치 유대를 형성 수 있습니다. ) 부하. 단일 분자 연구 특정 단백질-단백질 상호 작용의 격리에 대 한 허용 하 고 모호 하지 않은 결과, 하지만 그들은 세포 환경의 복잡성에 대 한 계정을 하지 않습니다.

획기적인 실험 시연 AJs, FAs 등 여러 subcellular 구조, mechanosensitive, 고 전시 내부적으로 생성 또는 외부 적용 부하^{18,19에 향상 된 어셈블리 20,,2122}. 또한, 몇 가지 이론적 모델 mechanosensitive 어셈블리 힘에 민감한 단백질 역동성^23,,2425에 의해 구동 될 수 있는 제안 했다. 살아있는 세포 내에서 이러한 힘 민감한 역학 검사, 몇 가지 간접 접근 촬영 되었습니다. FRAP 및 관련된 기술 셀^26,27,,2829단백질 역학을 측정 하기 위한 비교적 간단한 방법론을 제공 합니다. 그러나, 단백질 부하의 측정 더 제한 되었습니다. 일반적인 방법은 셀 전체 세포 수축^8,,3031을 줄이기 위해 사용 cytoskeletal 억제제에 노출 없이 단백질 역동성을 비교할 것입니다. 개념적으로, 이것은 높은 부하와 낮은 부하 상태 사이의 비교입니다. 그러나, 거기 아무 정량화 부하의 단백질에서 어느 상태에 이며 억제제, F 걸 필 라 멘 트에 따라 키 바인딩 사이트의 손실 등의 의도 하지 않은 생 화 확 적인 효과 있을 수 있습니다. 또 다른 방법은, FAs, 관련 FA 견인 힘 현미경 검사 법을 사용 하 여 분자 부하 대략적인 FA³²내 단일 단백질의 역학 관계를 조사 하 여 기판에 총 힘 노력을 측정 하고있다. 총 힘의 부 량이 접근이 방식을 사용 하면, 그것은 분자로 특정 정보를 제공 하지 않습니다. FAs는 많은 부하³³을 견딜 수 있는 200 개 이상의 서로 다른 단백질의 구성 되어 있습니다. 따라서, 잠재적으로 FA의 총 힘 출력을 측정 여러 힘 전송 경로 가능성을 가린다 고 안정적으로 부하의 측정을 특정 단백질에 제공 하지 않습니다.

Mechanobiology에 이전 접근, 달리 무서 워 기반 긴장 센서의 출현 수 직접 생활 안에 특정 단백질에 의해 발생 하는 부하의 측정 셀^34,,3536. 여기, 선물이 FRAP 기반 측정 단백질 역동성의 긴장 초조해 기반 센서를 결합 하는 프로토콜. 우리 졸라 무서 워 서이 기술을 참조 하십시오. 이 방법은 단백질 부하 및 살아있는 세포 (그림 1)의 힘에 민감한 단백질 역학 평가 되므로 단백질 역동성의 동시 측정을 수 있습니다. 이미, 무서 워 졸라 기술 기계 링커 단백질 vinculin³⁷의 힘-민감한 역학의 연구에 적용 되었습니다. 장력 센서 다양 한 subcellular 구조에에서 관련 된 수많은 단백질을 위해 개발 되었습니다. 예를 들어 센서 vinculin³⁴ 와 중부^38,39 FAs, cadherins 및 AJs^40,,4142, 복잡 한 핵 링컨에서 nesprin에에서 catenins에 개발 되었습니다. ⁴³, α-actinin⁴⁴ , filamin³⁶ , 골격 및 MUC-1는 glycocalyx⁴⁵, 다른 사람 사이에⁴⁶. 마찬가지로, FRAP 초점 유착^8,31, 외화 접속점⁴⁷, 말라 피²⁶, 및 핵⁴⁸mechanosensitive 단백질에 일반적으로 사용 되는 기술 사용 되었습니다입니다. 이러한 기존의 센서 또는 새로 무서 워 졸라 기술에 광범위 하 게 적용 해야 앞으로, 이동 센서, 다양 한 subcellular 구조 및 상황에에서 힘 민감한 역학의 측정에 대 한 수 있도록 개발. 이 끝, 무서 워 졸라 기술 적용이 다른 시스템에 구현 하기 위한 상세한, 일반화 된 프로토콜을 제공 합니다. 바라 건 대,이 다양 한 실험 elucidating 다양 한 mechanosensitive 단백질 힘 전송 규제 및 셀 행동 중재의 역할을 수 있게 된다.

Protocol

1. 영상에 대 한 샘플을 생성 합니다. 원하는 셀에 안정적으로 빠른 긴장 센서 구성 합니다. PRRL 벡터 또는 다른 바이러스 성 식 플라스 미드로 긴장 센서 구조를 복제.참고: 여러 가지 분자 복제 도구 제한 효소의 사용을 포함 하 여이 단계를 달성, 확장, 및 깁슨 어셈블리35중복 사용할 수 있습니다. PRRL 벡터 lenti 바이러스 성 변환에 사용 되 고 인간의 세포 (CMV) 발?…

Representative Results

무서 워 FRAP 두 형광 기술 조합 구성, 무서 워 및 FRAP. 우리가 단백질 부하의 효과에 초점을 맞춘, 우리 무서 워 기반 긴장 센서34,46을 사용 하 고. 이 센서는 종종 긴장의 mTFP1와 VenusA206K, flagelliform 링커 (그림 1A)로 연결 하 여 두 개의 형광 단백질으로 구성 된 모듈을 감지 기반으로 합니다. 모듈 단백질의 머?…

Discussion

무서 워 졸라 메서드 힘에 민감한 단백질 역동성, 살아있는 세포 내부 직접 조사 하기 어려운 속성의 직접 측정 하기 위한 수 있습니다. 분자 중에 단백질 역동성의 감도 힘 송신기 또는 변환기로 단백질의 기능에 중대 하다. 로드는 내부적으로 생성 된 둘 다의 전송에 대 한 필요 그리고 외부에서 적용 된 힘, mechanotransmission, 라는 화학적 감지 신호로 그 세력의 변환에 대 한 mechanotransduction 라는. 그…

Materials

0.05% Trypsin-EDTA	Thermo Fisher	25300062
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	30525-89-4
60x Objective NA1.35	Olympus	UPLSAPO 60XO
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)	Gibco	15240-062
Automated Stage	Prior Scientific	H117EIX3
Custom Dichroic Mirror	Chroma Technology Corp		T450/514rpc
Custom mTFP1 Emission Filter	Chroma Technology Corp		ET485/20m
Custom mTFP1 Excitation Filter	Chroma Technology Corp		ET450/30x
Custom Venus Excitation Filter	Chroma Technology Corp		ET514/10x
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium	Sapphire	MC102
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma Aldrich	D5796	with L-glutamine and sodium bicarbonate
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30396.03
Fibronectin, Human	Corning	47743-654
FRAPPA Calibration Slide	Andor		provided along with FRAPPA unit
FRAPPA System with 515 nm Laser	Andor
Glass-bottomed Fluoro Dishes	World Precision Instruments	FD35
HEK293-T Cells	ATCC	CRL-3216
Hexadimethrine Bromide, Polybrene	Sigma Aldrich	H9268-5G
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma Aldrich	D6429
Inverted Fluorescent Microscope	Olympus	IX83
JMP Pro Software	SAS
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels	Sutter Instruments	LB10-NW
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb	Sutter Instruments	LS/OF30
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-027
MATLAB Software	Mathworks
MEM Non-Essential Amino Acids	Thermo Fisher	11140050
MetaMorph for Olympus	Olympus
Micro-Humidification System	Bioptechs	130708
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter	Beckman Coulter	B25982
Objective Heater Medium	Bioptechs	150819-13
OptiMEM	Thermo Fisher	31985070
Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537
pMD2.G Envelope Plasmid	Addgene	12259
pRRL Vector			gift from Dr. Kam Leong (Columbia University)
psPax2 Packaging Plasmid	Addgene	12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera	Hamamatsu Photonics	C11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge	Thermo Fisher	75004505
Stable Z Stage Warmer	Bioptechs	403-1926
Venus Emission Filter	Semrock	FF01-571/72