Måling av Force-Sensitive Protein dynamikk i levende celler ved hjelp av en kombinasjon av fluorescerende teknikker

Summary

Her presenterer vi en protokoll for samtidig bruk av han selvmord resonans energi overføring-basert spenning sensorer for å måle protein belastning og fluorescens gjenoppretting etter photobleaching å måle protein dynamics slik at måling av kraft-sensitive protein dynamikken i levende celler.

Abstract

Celler forstand og svare på fysiske signaler i miljøet ved å konvertere mekanisk stimuli til biokjemisk-detectable signaler i en prosess som kalles mechanotransduction. Et avgjørende skritt i mechanotransduction er overføring av styrker mellom de eksterne og interne miljøene. Å sende styrker, må det være en vedvarende, ubrutt fysiske koblingen laget av en rekke protein-protein interaksjoner. For en gitt protein-protein interaksjon, mekanisk belastning kan enten har ingen innvirkning på samspill, føre til raskere tilknytningene til samhandlingen, eller aften stabilisere samhandlingen. Forstå hvordan molekylær Last dikterer protein omsetning i levende celler kan gi verdifull informasjon om mekaniske staten en protein, igjen Klargjørende sin rolle i mechanotransduction. Eksisterende teknikker for måling av kraft-sensitive protein dynamics enten mangler direkte målinger av protein belastning eller stole på målinger utført enhetskontroll mobilnettet. Her beskriver vi en protokoll for han selvmord resonans energi overføring-fluorescens utvinning etter photobleaching (bånd-FRAP) teknikk, som gjør at måling av kraft-sensitive protein dynamikken i levende celler. Denne teknikken er potensielt gjelder enhver bånd-baserte spenning sensor, tilrettelegge studiet av kraft-sensitive protein dynamikken i rekke subcellular strukturer og ulike celletyper.

Introduction

Ekstracellulære miljøet er en rik kilde til både biokjemiske og fysiske signaler som styrer celle atferd. Spesielt kan fysisk natur av microenvironment formidle viktige cellulære funksjoner, inkludert cellevekst, migrasjon og differensiering^1,2,3,4. Feilregulering om mekanikken i microenvironment er en kritisk komponent for mange sykdommer som ennå ikke har tilstrekkelig behandlinger, for eksempel kreft⁵, aterosklerose⁶og fibrose⁷. En fullstendig forståelse av hvordan celler konvertere fysiske stimuli til biokjemisk-detectable signaler, en prosess kalt mechanotransduction, krever utviklingen av molekylære mekanismer formidling styrke overføring, både inn og ut av cellene og innen flere subcellular strukturer.

I subcellular strukturer blir proteiner stadig over; bindende og frigiving basert på styrken av deres interaksjon med bindende partnere⁸. For styrker å være overføres over en fysisk avstand, må det være en ubrutt klareringskjede protein-protein interaksjoner, betyr at et protein omsetning må være treg nok til å opprettholde og overføre makt til sin bindende partner⁹. Mens protein-protein interaksjoner består vanligvis av flere ikke-kovalente bindinger mellom protein domenene, er samspillet ofte definert som en bundet tilstand som kan gå til en ubundet tilstand under ulike forhold^{10, 11}. en gitt protein-protein interaksjon, er det mulig at makt kan har ingen effekt på levetiden til samhandling, kjent som en “ideell bånd”, redusere levetiden til samhandling, kjent som en “slip bånd”, eller øke levetiden til samhandlingen , kjent som en “catch bånd”¹⁰. Således, det er en intrikat sammenheng mellom protein belastning og protein dynamikk, som vi kaller kraft-sensitive dynamikk.

Mot å forstå effekten av belastningen på bond dynamics, har en rekke svært informativ eksperimenter utført på enkelt-molekylet nivå. Bruker isolert proteiner eller fragmenter av proteiner og manipulasjon teknikker som magnetiske pinsett, optisk pinsett og atomic force mikroskopi, har disse studiene vist kraft-sensitive protein-protein interaksjoner i flere relevante proteiner^11,12. Begge integrins¹³ og cadherins¹⁴, som transmembrane proteiner viktig for å danne celle-matrise og celle-celle interaksjoner, henholdsvis, har vist endringer i dynamics grunn for å laste. Inne i cellen, vinculin er rekruttert til begge talin¹⁵ og α-catenin¹⁶ i en makt-avhengige måte og kan danne en fange bånd med utgangen¹⁷, som indikerer en avgjørende rolle for vinculin både fokal adhesjon (FAs) og adherens veikryss (AJs ) under belastning. Single-molekylet studier tillater isolering av bestemt protein-protein interaksjoner og entydig resultater, men de ikke gjøre rede for kompleksiteten i mobilnettet miljø.

Landemerke eksperimenter har vist at flere subcellular strukturer, inkludert FAs og AJs, er mechanosensitive, og viser forbedret montering svar på internt generert eller eksternt brukte laster^{18,19, 20,21,22}. I tillegg har flere teoretiske modeller antydet at mechanosensitive montering kan være drevet av kraft-sensitive protein dynamics^23,24,25. For å undersøke disse kraft-sensitive dynamikk i levende celler, er noen indirekte tilnærminger tatt. FRAP og relaterte teknikker gi en relativt enkel metodikk for måling av protein dynamikk i celler^26,27,28,29. Måling av protein belastning har imidlertid vært mer begrenset. En typisk bruksmåte er å sammenligne protein dynamikk i celler med og uten eksponering en cellen cytoskjelett hemmer brukes til å redusere totale celle contractility^8,30,31. Konseptuelt, er dette en sammenligning mellom høy belastning og lav belastning tilstand. Men det er ingen kvantifisering av lasten over protein i enten tilstand, og det kan være utilsiktet biokjemiske effekter av hemmer, slike tap av viktige bindende områder langs en F-utgangen filament. En annen tilnærming, gjelder for FAs, har vært å måle sum force anstrengelse på underlaget av FA bruker trekkraft force mikroskopi omtrentlig molekylær belastning og undersøke forholdet dynamikken i et enkelt protein i FA³². Mens denne tilnærmingen lar for kvantifisering av total makt, gir det ikke molecularly spesifikk informasjon. FAs består av over 200 ulike proteiner, hvorav mange kan bære belastningen³³. Dermed måle det sum force produksjonen av en FA potensielt tilslører muligheten av flere kraft overføring og gir ikke pålitelig et mål av belastningen på et bestemt protein.

I motsetning til tidligere tilnærmingene i mechanobiology, bruk av bånd-baserte spenning sensorer kan direkte måling av laster oppleves av spesifikke proteiner i levende celler^34,35,36. Her presenterer vi en protokoll som kombinerer bånd-baserte spenning sensorer med FRAP-baserte mål av protein dynamikk. Vi kaller denne teknikken bånd-FRAP. Denne tilnærmingen kan samtidig måling av protein belastning og protein dynamikk, slik at vurdering av kraft-sensitive protein dynamikken i levende celler (figur 1). Allerede, er bånd-FRAP teknikken brukt til studiet av kraft-sensitive dynamikk av mekanisk koblingsfunksjonalitet protein vinculin³⁷. Spenning sensorer har blitt utviklet for mange proteiner som er relevante i en rekke subcellular strukturer. For eksempel har sensorer blitt utviklet for vinculin³⁴ og talin^38,39 FAs, cadherins og catenins i AJs^40,41,42, nesprin i kjernefysiske LINC komplekse ⁴³, α-actinin⁴⁴ og filamin³⁶ i cytoskeleton og MUC-1 i glycocalyx⁴⁵, blant annet⁴⁶. Tilsvarende er FRAP en vanlig teknikk er brukt på mechanosensitive proteiner i fokal adhesjon^8,31, adherens veikryss⁴⁷, begrepsordbok cortex²⁶og kjernen⁴⁸. Fremover, bånd-FRAP teknikken skal være bredt aktuelt til noen av disse eksisterende sensorer eller nylig utviklet sensorer, slik at målinger av kraft-sensitive dynamikk i en rekke subcellular strukturer og sammenhenger. Mot dette formål gir vi en detaljert, generalisert protokoll for implementering av bånd-FRAP teknikk i disse forskjellige systemer. Forhåpentligvis aktiverer dette en rekke eksperimenter Klargjørende rollene av mechanosensitive regulerer kraft overføring og formidling celle atferd.

Protocol

1. Generer prøver for Imaging Stabilt uttrykke spenningen sensor konstruere i ønsket celle type. Klone spenning sensor konstruere inn pRRL vektor- eller andre viral uttrykk plasmider.Merk: Flere ulike molekylær kloning verktøy er tilgjengelig for å oppnå dette trinnet inkludert bruk av begrensning enzymer, overlapper utvidelsen, og Gibson montering35. PRRL-vektor brukes i lenti viral signaltransduksjon og gjør en betydelig grad av protein produksjon gjennom bruk av men…

Representative Results

BÅND-FRAP består av en kombinasjon av to fluorescerende teknikker, bekymre og FRAP. Som vi fokusert på effekten av protein belastning, brukte vi bånd-baserte spenning sensorer34,46. Disse sensorene er ofte basert på en spenning sensing modul som består av to fluorescerende proteiner, som mTFP1 og VenusA206K, sammen med et flagelliform linker (figur 1A). Når modulen er plassert mellom hodet og b…

Discussion

BÅND-FRAP metoden tillater direkte måling av kraft-sensitive protein dynamikk, en egenskap som har vært vanskelig å direkte undersøke i levende celler. Følsomheten til protein dynamics molekylær lastes er kritisk til protein’s fungerer som en kraft senderen eller transduktor. Lasting kreves for overføring av både internt generert og eksternt brukte styrker, kalt mechanotransmission, og for konvertering av disse styrkene til biokjemisk-detectable signaler, kalt mechanotransduction. Imidlertid endringer i belastni…

Materials

0.05% Trypsin-EDTA	Thermo Fisher	25300062
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	30525-89-4
60x Objective NA1.35	Olympus	UPLSAPO 60XO
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)	Gibco	15240-062
Automated Stage	Prior Scientific	H117EIX3
Custom Dichroic Mirror	Chroma Technology Corp		T450/514rpc
Custom mTFP1 Emission Filter	Chroma Technology Corp		ET485/20m
Custom mTFP1 Excitation Filter	Chroma Technology Corp		ET450/30x
Custom Venus Excitation Filter	Chroma Technology Corp		ET514/10x
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium	Sapphire	MC102
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma Aldrich	D5796	with L-glutamine and sodium bicarbonate
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30396.03
Fibronectin, Human	Corning	47743-654
FRAPPA Calibration Slide	Andor		provided along with FRAPPA unit
FRAPPA System with 515 nm Laser	Andor
Glass-bottomed Fluoro Dishes	World Precision Instruments	FD35
HEK293-T Cells	ATCC	CRL-3216
Hexadimethrine Bromide, Polybrene	Sigma Aldrich	H9268-5G
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma Aldrich	D6429
Inverted Fluorescent Microscope	Olympus	IX83
JMP Pro Software	SAS
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels	Sutter Instruments	LB10-NW
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb	Sutter Instruments	LS/OF30
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-027
MATLAB Software	Mathworks
MEM Non-Essential Amino Acids	Thermo Fisher	11140050
MetaMorph for Olympus	Olympus
Micro-Humidification System	Bioptechs	130708
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter	Beckman Coulter	B25982
Objective Heater Medium	Bioptechs	150819-13
OptiMEM	Thermo Fisher	31985070
Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537
pMD2.G Envelope Plasmid	Addgene	12259
pRRL Vector			gift from Dr. Kam Leong (Columbia University)
psPax2 Packaging Plasmid	Addgene	12260
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera	Hamamatsu Photonics	C11440-22CU
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge	Thermo Fisher	75004505
Stable Z Stage Warmer	Bioptechs	403-1926
Venus Emission Filter	Semrock	FF01-571/72