SINEUPs er syntetiske antisense ikke-kodende RNA’er, som indeholder en bindende domæne (BD) og en effektor domæne (ED) og op-regulere oversættelse af målrette mRNA. Her, beskriver vi detektionsmetoder for SINEUPs i kulturperler cellelinjer, analyse af deres oversættelse-fremme aktiviteten af Western-skamplet og en semi-automatiske høj overførselshastighed imaging system.
Målrettede protein ekstraudstyr er af betydning ikke blot for studier af biologiske processer, men også for terapeutiske og bioteknologiske applikationer. Vi præsenterer her, en metode til at selektivt op-regulere protein udtryk for ønskede gener i kulturperler celler ved hjælp af syntetiske antisensstoffer ikke-kodende RNA’er kendt som SINEUPs. Denne positive kontrol af genekspression er på det post-transcriptional niveau og udøves af en omvendt kort spækket nukleare element (sinus) Gentag 3ʹ slutningen af SINEUPs der omfatter dens effektor domæne (ED). SINEUPs kan specielt binder sig til hvilken som helst protein-kodning mRNA valg gennem dets bindende domæne (BD), en region, der er designet til at supplere sekvensen i 5ʹ utranslaterede region (5ʹ UTR) og omkring start codon af mRNA. Target-specifik SINEUPs beregnet på denne måde er transfekteret til kulturperler celler og proteiner og RNA udpakkes nedstrøms analyser, normalt 24-48 h efter Transfektion. SINEUP-induceret protein op-forordning er opdaget af Western-skamplet analyse og RNA udtryk er målt ved hjælp af real-time kvantitativ reverse transkription PCR. Vi har konstateret, at BD design er afgørende for at opnå optimal SINEUP aktivitet og at teste forskellige BD størrelser og holdninger med hensyn til start codon målet mRNA anbefales. Derfor, vi beskriver her en semi-automatiske høj overførselshastighed billedbehandling metode baseret på fluorescens opdagelse, der kan omsættes til target mRNA sammensmeltet med grøn fluorescerende proteiner (NGL). SINEUPs styrke specifikt oversættelse inden for normale fysiologiske interval i cellen, uden at ændre udskrift målniveau. Denne metode er blevet med held ansat mod en vifte af endogene og eksogene mål, i en lang række menneskelige, mus og insekter cellelinjer sammen med in vivo systemer. Desuden er SINEUPs blevet rapporteret at øge antistof produktion og arbejde som et RNA terapeutiske mod haploinsufficient gener. SINEUPs alsidig og modulære karakter gør dem et egnet redskab til at gen-specifikke Translationel kontrol.
I post-genom æra, mange indsigter har opnået ind gen regulerende roller ikke-kodende antisense udskrifter på grund af udviklingen af næste generation sequencing teknologier1,2,3 og gen-redigeringsværktøjer. Denne kategori af udskrifter, som blev tidligere anset for at være “transcriptional trash”, er nu etableret som en central aktør i genetiske forordning. Antisense udskrifter er rapporteret til at modulere kromatin og kontrol stabilitet og udtryk for deres beslægtet protein-kodning forstand mRNA4,5. I de fleste tilfælde, denne forordning er negative og antisense udskrifter tavshed deres forstand modparter gennem RNA-RNA interaktioner6,7. Dette træk af naturlige antisense udskrifter er blevet udnyttet til at nedregulere ønskede gener i form af syntetiske lille interfererende RNA (siRNA), mikroRNA (miRNA) og antisense oligos (ASO)8,9,10 ,11 forlader et teknologisk tomrum for målrettet genregulering op.
En spændende undersøgelse ændrede perspektiv for feltet antisense RNA ved at demonstrere at antisensstoffer længe ikke-kodende RNA’er (som lncRNAs) af generne Uchl1 (ubiquitin C-terminale hydrolase L1) og Uxt (allestedsnærværende udtrykt udskrift) positivt regulere oversættelse af deres cognate fornemme mRNA på det post-transcriptional niveau i mus12. 5ʹ slutningen af disse afbrudt lncRNAs overlapper med flere baser i 5ʹ utranslaterede region (5ʹ UTR) af deres tilsvarende følelse udskrifter, og den ikke-overlappende 3ʹ ende indeholder en inverteret gentagelse af en retrotransposon, der tilhører kort nukleare element (sinus) familie. Interessant, fandt vi, at den vigtigste drivkraft bag denne translationel op-forordning er den integrerede sinus gentage og det er ikke begrænset til musen sinus gentager kun. Menneskelige Alu repeat-holdige navngivet som lncRNAs også forbedret oversættelsen af target forstand mRNAs, styrke idéen om en ny klasse af sinus-drevet regulerende antisensstoffer ikke-kodende RNA’er, passende SINEUPs13. De seneste undersøgelser viste, at potentialet i naturlige SINEUPs er bevaret i syntetisk SINEUPs designet til specifikt mål forskellige endogene og eksogene gener14,15. SINEUPs har to vigtige funktioner: første “bindende domæne” (BD) som er generelt den 5ʹ ende region komplementær til den sekvens, som omfatter primære start codon af en protein-kodning mRNA, og anden “effektor domæne” (ED) som det inkorporerer en inverteret gentagelse af sinus, hvilket er en forudsætning for SINEUP funktion14 (figur 1). SINEUPs kan tilpasses til at designe en BD specifikt er rettet mod et gen af valg. Dette kan derefter udnyttes for at dissekere funktion af et bestemt gen involveret i en biologisk sti, som et bedre alternativ til en konventionel mRNA overekspression strategi. Desuden denne alsidig værktøj kan anvendes til at styrke antistof produktion, og som et lægemiddel til behandling af haploinsufficient sygdomme forårsaget af utilstrækkelig doser af funktionelle proteiner16,17,18, 19,20,21.
Fordelene ved SINEUP teknologi er mangfoldige. Det ændrer ikke udtryk for målet på det transkriptionel niveau. Længere BDs give flere specificitet til SINEUPs, mens ikke fremkalde en dsRNA-afhængige stress reaktion15. Protein induktion opretholdes inden for den normale fysiologiske vifte af cellen, forhindrer enhver skadelig indvirkning på grund af afvigende eller overdreven protein udtryk. SINEUPs er kompatibel med en lang række mus, menneskelige, og hamster kulturperler cellelinjer, for eksempel, HEK293T/17, HepG2, HeLa, CHO, MN9D og mange flere12,13,14,15,18 ,19. SINEUPs kan effektivt målrette endogene gener, forbigående overexpressed gener og FLAG-mærket eller luciferase-fusion gener, hvilket eliminerer behovet for gen-specifikke antistoffer14,18. Den grundlæggende SINEUP analyse kræver rutine cellekultur, Transfektion, sodium dodecyl sulfat-polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE), realtid kvantitative reverse transkription-polymerase kæde reaktion (qRT-PCR) instrumenter og indstillinger, og ekspertise kan opnås på kort tid.
Her, beskriver vi en metode for målretning gener med syntetisk SINEUPs op-regulere oversættelse, en effekt i modsætning til andre teknologier såsom RNA interferens9 og ASO gapmers11,22,23. En meget udbredt metode til RNA-styrede genaktivering er grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentager-baseret aktivering (CRISPRa), hvor genekspressionen udløses på det transkriptionel niveau24. Denne metode, men enkel og hurtig, kræver flere enkelt guide RNA’er (sgRNAs) rettet mod det samme gen for højere effektivitet, hvilket øger chancerne for off-mål bindende25. Desuden den centrale enzym af CRISPRa systemet, katalytisk døde CRISPR-forbundet protein 9 (dCas9) har lav bindende specificitet og sgRNAs rettet mod bi-directional promotor regioner kan ikke-specifikt op-regulere i nærheden gener25. Omvendt, SINEUPs binder målretter mRNA på en enkelt bindende region med høj specificitet og påvirker ikke udtryk for nærliggende gener. Vi diskutere de grundlæggende trin involveret i SINEUP design, Transfektion, proteiner og RNA udtryk analyser. Desuden præsenterer vi en semi-automatiske, høj overførselshastighed billedbehandlingssystem gennemgå flere SINEUPs på én gang, hvilket er nyttigt til påvisning af optimal SINEUPs.
Vi beskrevet her en protokol til at specifikt øge protein produktion af mål mRNA ved hjælp af en sinus-der indeholder ikke-kodende RNA, kaldet SINEUPs. Som et repræsentativt eksempel, er optimal syntetiske SINEUP-normal god landbrugspraksis vist at op-regulere oversættelse af normal god landbrugspraksis mRNA 2.6-fold målt ved Western blot analyse.
Designe en optimal BD er afgørende for at sikre SINEUP specificitet og potens (omfanget af protein op-regulering). Tidligere vi screening 17 BDs af SINEUP-NGL med Western blot analyse15 og fundet, at den optimale BD overlapper AUG-KOZAK-sekvensen af normal god landbrugspraksis mRNA, selvom det ikke måske være tilfældet med andre mRNAs og skal kontrolleres for hver enkelt sag. En anden uafhængig gruppe også screenet BD benytter en anden metode31. Som screening mange BDs kan være ret tidskrævende og besværlige, indført vi en høj overførselshastighed SINEUP påvisningsmetode her. Denne metode måler relative ændringer i normal god landbrugspraksis integreret tæthed i SINEUP transfekteret-celler i forhold til kontrol vektor transfekteret-celler. For at sikre at cellerne i en særlig godt af en kultur plade er transfekteret lige så og normal god landbrugspraksis signal er ikke koncentreret til kun en bestemt region af brønden, er det meget vigtigt at distribuere celler ligeligt i brønde i trin 2.1. Til dette formål, forsigtigt ryste plade 10 gange frem og tilbage (↑↓) efter såning celler inde i en ren bænk og Gentag i 5% CO2 inkubator før du starter inkubationen.
En anden kritisk trin er beregningen af proteinkoncentration taktfast 3.3. Fejlberegninger her kan føre til indlæsning af en forkert mængde protein under Western-skamplet analyse, dermed forhindre påvisning af små ændringer i protein udtryk af nogle af de svage SINEUPs eller generere falske positiver fra overbelastning. Det anbefales at frisk forberede protein standardkurven hver gang, og sørg for, at lige store mængder af standarder og protein prøver måles i trin 3.3.3. Protokollen beskrevet her fokuserer på SINEUP-normal god landbrugspraksis, men Western-skamplet analyse kan bruges til nogen målrette mRNA af interesse. Inkubationstiden og koncentration af antistoffer bør optimeres for hvert mål at få det bedste resultat.
En af de unikke kendetegn ved SINEUPs er, at målet-mRNA udtryk niveau forbliver upåvirket. Det er vigtigt at behandle RNA med DNase til at undgå afsløring af transfekteret SINEUPs og genomisk DNA af qRT-PCR. SINEUP RNA’er og target mRNA udtryk bør måles på qRT-PCR at bekræfte succes både Transfektion og SINEUP aktivitet. SINEUPs indeholder en sinus sekvens, som er rigelige i hele både menneskelige og mus genomer. For at undgå ikke-specifik detektion af sinus sekvenser, er det ikke anbefales at designe qRT-PCR primere til sinus sekvens.
Vi brugte humane cellelinjer i denne protokol, men SINEUPs er effektiv i en række cellelinier fra flere forskellige arter12,13,14,18,19. Celle kultur og Transfektion betingelser kan ændres afhængig forskellige cellelinjer, så længe disse opretholde Transfektion effektivitet af SINEUP vektorer. Derudover kan alternative metoder for RNA udvinding, cDNA syntese, og protein koncentration kontrol ansat, eftersom at de bevare den krævede RNA og protein kvalitet for qRT-PCR og Western blot analyse. Mens vi brugte en specifik høj overførselshastighed mikro-godt Flowcytometret, som aktiveret registrering af normal god landbrugspraksis fluorescens på tværs af hele brønden, kan andre cytometers med en lignende registreringsområde brugte31. Det er værd at bemærke, at hvis fordelingen af celler og Transfektion er ens overalt i en brønd, så det ikke er nødvendigt at scanne hele brønden for normal god landbrugspraksis fluorescens: halvdelen eller en fjerdedel af området med et brønd kan være nok til at skimte SINEUP virkning afhængig af eksperiment Al færdigheder.
Oprettelse af en høj overførselshastighed SINEUP opdagelse protokol giver mulighed for samtidige screening af flere BDs rettet mod en given mRNA i kulturperler celler. Dette er vigtigt, da reglerne for optimal målretning af BD er stadig uklare. Sådan en multiplex screening system giver mulighed for omfattende afprøvning af mange SINEUPs mod forskellige gener, nyttige for at målrette flere gener involveret i en bestemt signalvejen for eksempel. Derudover det kan udnyttes til at udvide search for effektiv SINEUPs rettet mod flere mRNAs, designe forskellige SINEUP BDs omkring august-Kozak region (Se figur 1), co transfecting fuld længde mål mRNAs (5ʹ UTR-cd’er-3ʹ UTR) sammensmeltet med normal god landbrugspraksis mRNA i dyrkede celler til at finde den optimale SINEUPs, og efterfølgende test BD kandidater mod endogene mRNA i kulturperler celler og in vivo model dyr, fra mennesker og mus til andre dyr og plante arter.
Denne screening protokol er meget hurtig. Vi behøver ikke at lave og indsamle celler, men skal bare placere levende celle kultur plade i den billeddiagnostiske instrument. Vi foreslår at bruge denne high throughput screening protokol at vælge optimal BDs af SINEUPs og evaluere potentielle kandidater med Western blot analyse. Således kan valgte kandidater med optimal BDs anvendes til at øge antistof produktion18,19,21. Feltet RNA terapeutiske vokser i øjeblikket, dramatisk. For eksempel, er siRNA, ASO, mRNA og CRISPR RNA behandlingsformer, bredt ansat til at styre mRNA udtryk for deres respektive mål9,32. I denne sammenhæng, SINEUPs er i deres vorden, men indtil videre ingen af de undersøgte SINEUPs ændret udtryk for target mRNAs. Derudover SINEUPs redigerer ikke målrette mRNA, men kun op-regulere oversættelse af mRNA. Endvidere kan tab af funktion sygdomme som følge af haploinsufficiency blive ramt af SINEUP terapi, at opnå en 2-fold induktion af mangelfuld protein17,33. Selv om off-target virkninger skal undersøges yderligere, målrette SINEUPs potentielt og specielt en enkelt, udtrykt mRNA med en supplerende sekvens til BD.
En begrænsning af denne høj overførselshastighed protokol er, at det ikke er egnet til skærmen BDs af SINEUPs i in vivo musemodeller fordi protokollen foranstaltninger for normal god landbrugspraksis integreret intensitet kun. SINEUPs kan ikke naturlige antisense lncRNAs, der virker post-transcriptionally, de anvendes når målet mRNA er mangler i celler eller vævsprøver.
Ikke desto mindre, kan SINEUPs anvendes til forstærkning af funktion studier, at forbedre antistof produktion, og som et RNA terapi til op-regulere udtryk for mangelfuld proteiner inden for intervallet af 1,5-3,0-fold. De metoder, der beskrives her præsenterer en nyttig guide for at målrette og opdage SINEUP-induceret oversættelse forbedring af ønskede mRNA og giver et nyt værktøj for post-transcriptional RIBOREGULATION.
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse var delvist støttet af grundlæggende videnskab og Platform teknologi Program for Innovative biologisk medicin, no. 17 er 0301014, fra Japan Agency for medicinalforskning og udvikling (AMED), forskning tilskud fra MEXT RIKEN-Center for livet Videnskab teknologi og forskning tilskud fra MEXT til RIKEN IMS. Vi takke medlemmerne af PC lab og SINEUP netværket (SISSA, Universitet af østlige Piemonte og RIKEN) for tankevækkende drøftelser. Vi takker Dr. Matthew Valentine for korrekturlæsning.
Synthetic SINEUP | Cell Guidance Systems Ltd. in UK and K.K.DNAFORM in Japan | https://www.cellgs.com/items/sineupand8482.html and https://www.dnaform.jp/en/information/20130320 | Step 1.5. |
HEK293T/17 | ATCC | ATCC CRL-11268 | Step 2.1. |
Falcon Multiwell Plate For Cell Culture 6 well plate | Corning | 6902A01 | Step 2.1. |
Corning BioCoat Poly-D-Lysine 24 well Plate | Corning | 08-774-124 | Step 2.1. |
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | Step 2.2. |
pEGFP-C2 | Clontech | #6083-1 | Step 2.2. |
Cell Lysis Buffer (10x) | Cell Signaling Technology | #9803S | Step 3.1. This is pre-mixed cell lysis solution. |
PMSF | Cell Signaling Technology | #8553S | Step 3.1. To complete cell lysis buffer, add 0.005% (w/v) PMSF to 1 x cell lysis buffer. |
DC protein assay kit II | BIO RAD | #5000112JA | Step 3.3. |
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 12-well, 20 µl | BIO RAD | #4561035 | Step 4.2. |
Amersham Protran Premium NC 0.45 (150 mm×4 m) | Amasham | 10600013 | Step 4.3., This is a 0.45 µm nitrocellulose membrane. |
Nonfat Dry Milk | Cell Signaling Technology | #9999S | Step 4.4. A component of the blocking solution. |
GFP Tag Antibody | Thermo Fisher Scientific | A-6455 | Step 4.5. Lot number: 1495850, RRID: AB_221570 |
Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse | SIGMA | A5441 | Step 4.5. Lot number: 026M4780V, RRID: AB_476744 |
Polyclonal Goat Anti Rabbit Immunoglobulins | Dako | P0448 | Step 4.5. This is secondary antibody conjugating with HRP for anti GFP antibody. Lot number: 20017525, RRID:AB_2617138 |
Polyclonal Goat Anti mouse Immunoglobulins | Dako | P0447 | Step 4.5. This is secondary antibody conjugating with HRP for anti β-Actin antibody. Lot number: 20019698, RRID:AB_2617137 |
ECL Western Blotting Detection Reagents | Amersham | RPN2109 | Step 4.9. |
Maxwell Rapid Sample Concentrator (RSC) Instrument | Promega | AS4500 | Step 5.1. This is commercially available RNA exreaction instrument. |
Maxwell RSC simplyRNA Cells Kit | Promega | AS1390 | Step 5.1. This is commercially available RNA exreaction kit. |
TURBO DNA-free Kit | ambion | AM1907 | Step 5.2 and 5.4. The kit contains DNase, DNase buffer and inactivation reagent. |
PrimeScrip 1st strand cDNA Synthesis Kit | TaKaRa | 6110A | Step 6.1. The kit contains reagents of first strand cDNA synthesis. |
TB Green Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820A | Step 6.2. |
Hoechst3342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | Step 7.2. |
Celigo S | Nexcelom Bioscience | 200-BFFL-S | Step 7.3. This is a high throughput micro-well image cytometer. |