تجميد سطح الوظيفية للجينات باستخدام الطباعة الحجرية التشرد حبلا متعددة الخطوات
Summary
يصف لنا إجراء معدني بسيط للتثبيت جزيئات الحمض النووي الجيني-طول على سطح، التي يمكن استخدامها للقيام بتجارب تعبير الجينات الخلية الحرة في بيوتشيبس.
Abstract
يسمح التثبيت جينات على السطوح ليثوجرافيكالي منظم دراسة الجينات المجزأة عمليات التعبير في نظام مفاعل حيوي موائع جزيئية مفتوحة. على النقيض من النهج الأخرى نحو النظم الخلوية مصطنعة، يسمح هذا إعداد لإمداد متواصل مع الكواشف التعبير الجيني وتجفيف متزامنة من منتجات النفايات. وهذا يسهل تنفيذ عمليات التعبير الجيني الخلية الحرة على مدى فترات طويلة من الزمن، هو أمر مهم لتحقيق نظم التغذية المرتدة التنظيمية الجينات الحيوية. هنا نقدم بروتوكول مفصل لتلفيق الوراثية بيوتشيبس استخدام بسيط باستخدام معدني أسلوب استناداً إلى ردود فعل التشرد حبلا الحمض النووي، الذي يستخدم حصرا المكونات المتوفرة تجارياً. نحن نقدم أيضا بروتوكول على إدماج الجينات المجزأ مع بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS)-على أساس نظام موائع جزيئية. وعلاوة على ذلك، نحن تظهر أن النظام متوافق مع انعكاس الداخلية مجموع الأسفار (TIRF) مجهرية، التي يمكن أن تستخدم للمراقبة المباشرة للتفاعلات الجزيئية بين الحمض النووي والجزيئات الواردة في مزيج التعبير.
Introduction
الخلية الحرة التعبير الجيني ردود الفعل ذات أهمية كبيرة لمختلف التطبيقات في الكيمياء الحيوية والتكنولوجيا الحيوية والبيولوجيا التركيبية. وكان التعبير الخلية خالية من البروتينات مفيدة لإعداد عينات البروتين النقي، التي كانت الأساس للعديد من الدراسات في علم الأحياء الهيكلية. على سبيل المثال، نظم خالية من الخلية بنجاح واستخدمت للتعبير عن البروتين المجمعات1 أو غشاء بروتينات2، التي يصعب أن تنتج باستخدام تعبير يستند إلى الخلية. جدير بالذكر أن الخلية خالية من التعبير الجيني ردود الفعل واستخدمت أيضا توضيح بنية الشفرة الجينية، بدءاً من التجارب الرائدة واسطة Nirenberg ومأتى في عام 19613.
في الآونة الأخيرة، كان هناك اهتمام جديد بأساليب الخلية الحرة في مجال التكنولوجيا الحيوية والبيولوجيا التركيبية4،،من56. ويمكن زيادة أنظمة الخلية خالية مع المركبات غير البيولوجية، ومكونات أصل بيولوجي متنوعة يمكن دمجها بسهولة أكبر7. على الرغم من أن أنظمة الخلية الحرة قد عيب واضح أن لم يفعلوا “تنمو وتقسيم”، تصور لإعداد مفتوحة المفاعلات الحيوية الخلية خالية مع الوظائف الأيضية الأساسية والسماح لهم بتجميع نواتج الأيض عند تزويدها بالطاقة والكربون بسيطة 8من المدخلات. في هذا المجال الناشئ من البيولوجيا التركيبية، وعد أنظمة الخلية الحرة لتكون أكثر قابلية للتنبؤ “هيكل” للتنفيذ الوظائف البيولوجية الاصطناعية.
حاليا، وردود فعل التعبير الجيني الخلية الحرة تنفذ أما باستخدام الخلية مقتطفات (من مصادر مختلفة مثل البكتيريا والخميرة والحشرات)، أو نظم الترجمة/النسخ التي تم الأمثل لتطبيقات مختلفة (مثلاً، بدائية مقابل التوكسينات التعبير الجيني، إنتاج بروتينات الغشاء، إلخ). بروتوكول شعبية للتحضير لاستخراج الخلايا البكتيرية (يسمى عادة تكستل) قدمت مؤخرا نويرو خامسا وزملاء العمل9. خصائصه الفيزيائية تتميز دقيق10، والنظام تكستل بالفعل استخدمت بنجاح لتنفيذ سلسلة من المهام المعقدة البيوكيميائية: مثلاً، جمعية bacteriophages الوظيفية عن طريق الخلية الحرة التعبير عن الجينوم بالعاثية11أو تخليق البروتين البكتيري خيوط12تنفيذ الجين الخلية الحرة الدوائر13،14.
نظام آخر شعبية في البيولوجيا التركيبية الخلية الحرة هو نظام الصرفة، التي يتم تشكيلها من مكونات المنقي15،16. مقارنة بنظام تكستل، أنه لا يحتوي على نوكليسيس أو إليه تدهور البروتين. بينما تدهور خطي الحمض الخلوي الصبغي، جزيئات الرنا أو البروتينات أقل من قضية في نظام الصرفة، ومسارات تسوس هامة فعلا لتنفيذ مهام الديناميكية. من أجل التقليل من تأثير تدهور [ااكسونوكلس] قوالب الجينات الخطي في النظام تكستل (عن طريق ريكبكد)، قد البروتين التجمع حماية نهاية المراد إضافتها. تكستل ونظام الصرفة متوفرة تجارياً.
موضوع ارتباطاً وثيقا بشواغل بيولوجيا الخلية الحرة دراسة أثر التقسيم في التفاعلات الكيميائية الحيوية، وكذلك إنشاء هياكل تشبه الخلية الاصطناعية أو بروتوسيلس17،18،19 ،20. البحث عن خلايا اصطناعية ينطوي عادة على تغليف نظام رد الفعل البيوكيميائية داخل مقصورات حويصلية مصنوعة من فوسفوليبيدات أو أمفيفيليس أخرى. بينما مثل هذه الأنظمة تساعد على استكشاف الجوانب الأساسية للتقسيم، أو ظهور سيلولاريتي وهياكل ذاتية، يواجهون مشاكل نموذجية من النظم المغلقة: في غياب الأيض بالأداء والمناسبة غشاء آليات النقل، من الصعب أن تبقى مجزأة ردود الفعل قيد التشغيل لفترات طويلة من الزمن–تستخدم جزيئات الوقود وتتراكم النفايات.
بديل لاهتمام للتجزيء داخل هذه المقصورات محاكاة الخلية هو تنظيم المواد الجينية باستخدام أساليب فوتوليثوغرفيك المكانية. التثبيت من “الجينات على رقاقة” كان رائدا من قبل فريق بار-زيف في معهد وايزمان منذ أكثر من عشر سنوات21. وكان من بين القضايا الرئيسية التي يتعين حلها الامتزاز غير محددة من الحمض النووي وتمسخ المحتملة من البروتينات على سطح الرقاقة. شريط-زيف et al. وضعت مقاومة التصويرية مخصص يسمى “زهرة الأقحوان”، الذي كان يتألف من رد الفعل سيلاني الطرفية للتثبيت جزيئات مقاومة على الأسطح ثاني أكسيد السيليكون، فاصل طويل البولي إثيلين غليكول (شماعة) التي أكدت توافق مع الحياة، وهيدجروب فوتوكليفابل، التي تم تحويلها إلى أمين رد الفعل عند التشعيع بالأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية). فقد ثبت أنه يمكن استخدام ديزي شل طول الجينات جزيئات الحامض النووي (مع أطوال عدة كيلو قاعدة أزواج (kbp)) على سطح رقاقة. من وجهة نظر فيزياء البوليمرات، تمثيل النظم فرش البوليمرات المطعمة على ركيزة صلبة. نظراً لطبيعة بولييليكتروليتي الحمض النووي، تكيف هذه الفرش تأثرا شديدا ناضح وغيرها من الآثار الخاصة بايون،من2223.
الأهم من ذلك، فقد ثبت أن جينات معطلة الركيزة فعالة ويمكن أن يدون وترجمتها إلى الجيش الملكي النيبالي، والبروتينات. فرش الجينات موجوداً لرنا بولمرس من حل24، وهو خليط الجزيئات المعقدة للترجمة/النسخ لا التشويه والتحريف في السطح. إحدى الميزات للتثبيت مكونات الوراثية على الركازة هو أن أنها يمكن أن تعمل في إطار نظام مفاعل موائع جزيئية مفتوحة التي يتم توفيرها بشكل مستمر مع جزيئات صغيرة السلائف ومن منتجات النفايات التي يمكن أن تكون إزالة25 , 26.
ونحن مؤخرا بوضع البديل من هذا الأسلوب الذي يطلق عليه بيفوري (لشعاع الإلكترون متوافق حيويا ومقاوم الضوء)27، التي تستند حصرا إلى المكونات المتاحة تجارياً والمستخدمة الخاصة بتسلسل الحمض النووي حبلا ردود الفعل للغزو أعمال الطباعة الحجرية متعددة الخطوات البسيطة لتنفيذ إجراء لإنشاء خلايا اصطناعية القائم على رقاقة. ويرد في الشكل 1نظرة تخطيطية للإجراء. ويستند على الحمض النووي دبوس الجزيئات التي تحتوي على مجموعة فوتوكليفابل، التي هي معطلة على طبقة شماعة متوافق حيويا. فوتوكليفاجي دبوس الكشف عن تسلسل تويهولد واحد-الذين تقطعت بهم السبل، من خلال الحمض النووي الذي يمكن جزيئات فائدة (التي تحتوي على تسلسل ديس “إلى تشريد”) المرفقة عن طريق غزو حبلا تويهولد بوساطة.
في حين يحتمل أن تكون أبسط لتنفيذ بيفر، ديزي يسمح أعمال كثيفة جداً ونظيفة “فرش الجينات”، التي لديها مزايا في تطبيقات معينة. من حيث المبدأ، ولكن الطباعة الحجرية ديزي وبيفوري يمكن بسهولة دمج. أسلوب الطباعة الحجرية ذات الصلة استخدام فرش التشرد حبلا الحمض النووي لهيكلة الحمض النووي في الذهب وقد وضعته سابقا هوانغ et al.، ولكن لم تستخدم في سياق تعبير الجينات الخلية الحرة28،29.
في البروتوكول التالي نقدم وصفاً مفصلاً لإنتاج الحمض النووي فرش للتعبير الجيني خالية من الخلية باستخدام الأسلوب بيفوري. يصف لنا كيف رقائق المورثات ملفقة وإثبات استخدام صور متعددة خطوة-الطباعة الحجرية للتثبيت مكانياً منظم للجينات على شريحة. نناقش أيضا تلفيق رد فعل الدوائر وتطبيق ميكروفلويديكس للقيام بردود فعل التعبير الجيني على شريحة.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطباعة الحجرية بيفر تقنية قوية وتنوعاً لتجميد منقوشة من الحمض النووي الريبي أو. حتى الآن، الإجراء الذي يتضمن العديد من الخطوات، التي-إذا تغيرت–يمكن أن تكون مصدرا للفشل أو تخفيض أداء النظام.
هو خطوة حاسمة في تصنيع رقائق بيفوري بيجيلاتيون الركازة، الذي يوفر في توافق مع الحي…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونعترف مع الامتنان الدعم المالي لهذا المشروع “ستيفتونغ فولكس واجن” (منحة رقم 89 883) و “مجلس البحوث الأوروبي” (اتفاق منحة رقم 694410-عدنا). س. م. س. وتسلم الدعم المقدم من DFG من خلال GRK 2062.
Materials
| Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 100 | |
| Silicon wafer (for PDMS master mold) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 76.2 (3”) | |
| Glass slides no. 4 | Menzel | 22 mm x 50 mm | |
| Glass slides no. 1.5 | Assistent | 24 mm x 24 mm | |
| Biotin-PEG-Silane | Laysan Bio | MW 5,000 | |
| Anhydrous toluene | Sigma Aldrich (Merck) | 244511 | |
| Streptavidin | Thermo-Fisher Scientific | S888 | |
| DNA | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | PCR kit |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Spin-column PCR clean-up kit |
| PURExpress | New England Biolabs | E6800S | Cell-free expression system |
| PDMS | Dow Corning | Slygard 184 | |
| FluoSpheres | Thermo-Fisher Scientific | F8771 | |
| PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm) | Bola | S 1810-10 | |
| EpoCore 20 | micro resist technology GmbH | Photoresist | |
| mr-Dev 600 | micro resist technology GmbH | Photoresist developer | |
| Ti-Prime | MicroChemicals | Adhesion promoter | |
| Two-component silicon glue | Picodent | Twinsil | |
| UV-protection yellow foil | Lithoprotect (via MicroChemicals) | Y520E212 | |
| Equipment | |||
| Masks for photolithography | Zitzmann GmbH | 64.000 dpi, 180×240 mm | |
| Upright microscope | Olympus | BX51 | Photolithography and fluorescence imaging |
| 60x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.9 |
| 20x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.5 |
| Camera | Photometrics | Coolsnap HQ | Used with Olympus BX51 |
| Ligtht source | EXFO | X-Cite 120Q | Used with Olympus BX51 |
| Inverted microscope | Nikon | Ti2-E | Fluorescence imaging of gene expression |
| 4x objective | Nikon | CFI P-Apo 4x Lambda | Used with Nikon Ti2-E |
| Camera | Andor | Neo5.5 | Used with Nikon Ti2-E |
| Light source | Lumencor | SOLA SM II | Used with Nikon Ti2-E |
| Cage incubator | Okolab | bold line | Used with Nikon Ti2-E |
| Pressure Controller | Elveflow | OB1 MK3 | |
| NanoPhotometer | Implen | DNA concentration measurement | |
| Plasma cleaner | Diener | Femto | 200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage |
Riferimenti
- Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip. Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).
- Jaehme, M., Michel, H. Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins – a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus. The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).
- Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 47, 1588-1602 (1961).
- Harris, D. C., Jewett, M. C. Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 672-678 (2012).
- Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).
- Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
- Estévez-Torres, A., et al. Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (30), 12219-12223 (2009).
- Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance. Nature Communications. 5 (1), 4113 (2014).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. Coarse-Grained Dynamics of Protein Synthesis in a Cell-Free System. Physical Review Letters. 106 (4), 048104 (2011).
- Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction. ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).
- Maeda, Y. T., et al. Assembly of MreB filaments on liposome membranes: a synthetic biology approach. ACS Synthetic Biology. 1 (2), 53-59 (2012).
- Shin, J., Noireaux, V. An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells. ACS Synthetic Biology. 1 (1), 29-41 (2012).
- Niederholtmeyer, H., et al. Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators. eLife. 4, e09771 (2015).
- Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
- Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. Protein synthesis by pure translation systems. Methods. 36 (3), 299-304 (2005).
- Pohorille, A., Deamer, D. Artificial cells: prospects for biotechnology. Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).
- Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
- Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., Leduc, P. Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems. Nature Nanotechnology. 8 (8), 602-608 (2013).
- van Nies, P., et al. Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based synthetic cells. Nature Communications. 9 (1), 1583 (2018).
- Buxboim, A., et al. A single-step photolithographic interface for cell-free gene expression and active biochips. Small. 3 (3), 500-510 (2007).
- Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface. Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).
- Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes. Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).
- Daube, S. S., Bracha, D., Buxboim, A., Bar-Ziv, R. H. Compartmentalization by directional gene expression. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 107 (7), 2836-2841 (2010).
- Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science. 345 (6198), 829-832 (2014).
- Tayar, A. M., Karzbrun, E., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Propagating gene expression fronts in a one-dimensional coupled system of artificial cells. Nature Physics. 11 (12), 1037-1041 (2015).
- Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H., Simmel, F. C. Gene Expression on DNA Biochips Patterned with Strand-Displacement Lithography. Angewandte Chemie-International Edition In English. 57 (17), 4783-4786 (2018).
- Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. Multicolor and Erasable DNA Photolithography. ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).
- Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction. Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).
- McDonald, J. C., et al. Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).
