Funktionale Oberfläche-Immobilisierung von Genen mit mehrstufigen Strang Verschiebung Lithographie
Summary
Wir beschreiben ein einfaches lithographischen Verfahren für die Immobilisierung von gen-Länge DNA-Molekülen auf einer Fläche, die zur zellfreien gen Ausdruck Experimente auf Biochips durchführen können.
Abstract
Immobilisierung von Genen auf lithographically strukturierte Oberflächen ermöglicht die Untersuchung der unterteilte gen Ausdruck Prozesse in einem offenen mikrofluidischen-Bioreaktor-System. Im Gegensatz zu anderen Ansätzen hin zu künstlichen zellulären Systemen erlaubt solch eine Einstellung für eine kontinuierliche Versorgung mit gen-Ausdruck-Reagenzien und gleichzeitige Entleerung von Abfallprodukten. Dies erleichtert die Umsetzung der zellfreien gen Ausdruck Prozesse über einen längeren Zeitraum der Zeit, die für die Realisierung von dynamischen gen regulatorischen rückgekoppelte Systeme wichtig. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Herstellung von genetischen Biochips mit einer einfach zu bedienenden lithographische Technik basierend auf DNA-Strang Versetzung Reaktionen, die ausschließlich handelsübliche Komponenten verwendet. Wir bieten auch ein Protokoll über die Integration der unterteilte Gene ein Polydimethylsiloxan (PDMS)-basiertes mikrofluidischen System. Darüber hinaus zeigen wir, dass das System mit Totalreflexion (TIRF) Fluoreszenzmikroskopie, vereinbar ist, für die direkte Beobachtung der molekularen Wechselwirkungen zwischen DNA und Moleküle in der Mischung Ausdruck verwendet werden kann.
Introduction
Zellfreie Genexpression, die Reaktionen von großem Interesse für die verschiedensten Anwendungen in der Biochemie, Biotechnologie und synthetische Biologie sind. Zellfreie Expression von Proteinen war maßgeblich für die Zubereitung von reines Proteinproben, die die Grundlage für zahlreiche Studien in der Strukturbiologie waren. Zum Beispiel zellfreien Systemen erfolgreich die Expression des Proteins komplexe1 oder Membran Proteine2, dienten die sind schwer zu produzieren, mit zellbasierten Ausdruck. Insbesondere zellfreie Genexpression, die Reaktionen auch verwendet wurden, um die Struktur des genetischen Codes, beginnend mit der bahnbrechenden Experimente durch Nirenberg und Matthaei in 19613aufzuklären.
Vor kurzem gab es ein erneutes Interesse an zellfreien Methoden in der Biotechnologie und synthetische Biologie4,5,6. Zellfreie Systeme können mit nicht-biologischen Verbindungen verstärkt werden, und Komponenten der verschiedenen biologischen Ursprungs können leichter7kombiniert werden. Obwohl zellfreien Systemen den scheinbaren Nachteil haben, den sie nicht “wachsen und sich teilen”, ist es denkbar, bereiten Sie offene zellfreie Bioreaktoren mit grundlegenden Funktionen des Stoffwechsels und lassen sie synthetisieren Metaboliten mit einfachen Kohlenstoff und Energie Eingänge8. In dem aufstrebenden Gebiet der synthetischen Biologie verspreche zellfreien Systemen, ein berechenbarer “Chassis” für die Umsetzung von synthetischen biologischen Funktionen.
Derzeit, zellfreie gen Ausdruck Reaktionen erfolgen entweder mit Zelle extrahiert (aus verschiedenen Quellen wie Bakterien, Hefe, Insekten), oder Transkription/Translation-Systeme für unterschiedliche Anwendungen (z. B. optimiert wurden prokaryotische vs. eukaryotischen Genexpression, Herstellung von Membranproteinen, etc.). Ein häufig verwendetes Protokoll, für die Vorbereitung der Bakterienzelle Extrakt (allgemein als TXTL bezeichnet) wurde vor kurzem von V. Noireaux und Kollegen9bereitgestellt. Seine biophysikalischen Eigenschaften wurden gründlich gekennzeichnet10, und das TXTL-System wurde bereits erfolgreich eingesetzt, eine Reihe von komplexen biochemischen Aufgaben durchzuführen: z. B. die Montage der funktionalen Bakteriophagen über zellfreie Ausdruck von Phagen Genom11, die Synthese der bakteriellen Protein Filamente12oder die Umsetzung von zellfreien gen Schaltungen13,14.
Beliebt in zellfreien synthetische Biologie ein anderes System ist das reine System, das aus gereinigten Komponenten15,16wieder hergestellt ist. Im Vergleich zu den TXTL-System, enthält es keine Nukleasen oder Protein-Abbau-Maschinen. Beim Abbau von linearen DNA RNA-Moleküle oder Proteine ist weniger ein Problem in der reinen System Verfall Wege sind wirklich wichtig für die Durchführung von dynamischen Funktionen. Um die Wirkung der Exonuclease Verschlechterung der linearen gen Vorlagen im TXTL System (durch RecBCD) zu verringern, hat das Ende schützen GamS Protein hinzugefügt werden. Die TXTL und das reine System sind im Handel erhältlich.
Ein Thema eng mit zellfreien Biologie betrifft die Studie über die Wirkung der Abschottung auf biochemischen Reaktionen, und weiter die Schaffung von künstlichen Zelle Strukturen oder Protozellen17,18,19 ,20. Forschung über künstliche Zellen umfasst in der Regel die Kapselung der eine biochemische Reaktion-System im Inneren vesikuläre Fächer aus Phospholipiden oder andere amphiphilen hergestellt. Während solcher Systeme helfen, um grundlegende Aspekte der Abschottung oder die Entstehung der Zellularität und selbstreplizierende Strukturen zu erkunden, sie konfrontiert die typischen Probleme von geschlossenen Systemen: in Ermangelung von einem funktionierenden Stoffwechsel und entsprechende Membran-Transport-Mechanismen, es ist schwierig, unterteilte Reaktionen laufen über einen längeren Zeitraum hinweg zu – Kraftstoff Moleküle sind aufgebraucht und Abfallprodukte sammeln.
Eine interessante Alternative zur Abschottung innerhalb dieser Zelle imitiert Fächer ist die räumliche Organisation des genetischen Materials mit photolithographische Methoden. Immobilisierung von “Gene auf einem Chip” wurde erstmals von der Bar-Ziv-Gruppe am Weizmann-Institut vor mehr als zehn Jahren21. Zu den wichtigen Fragen, die gelöst werden mussten waren die unspezifische Adsorption von DNA und die potenziellen Denaturierung der Proteine auf der Chipoberfläche. Bar-Ziv Et Al. entwickelt eine dedizierte Photolithographie Resist bezeichnet “Daisy”, bestehend aus einer reaktiven terminal Silan für Immobilisierung der Resist Moleküle auf Siliziumdioxid Oberflächen eine lange Polyethylenglykol (PEG) Abstandhalter war, die versicherte Biokompatibilität und eine Photocleavable Headgroup, die in einem reaktiven Amin bei Bestrahlung mit ultraviolettem (UV) Licht umgewandelt wurde. Es hat sich gezeigt, dass Daisy verwendet werden kann, um gen-Länge DNA-Moleküle (mit einer Länge von mehreren Kilo Basenpaare (Kbp)) auf einem Chip-Oberfläche zu immobilisieren. Aus einem Polymer Physik Standpunkt vertreten die Systeme Polymer Bürsten ein festes Substrat aufgepfropft. Polyelektrolyten aufgrund der DNA ist die Konformation dieser Bürsten osmotische und andere Ionen-spezifische Effekte22,23stark betroffen.
Am wichtigsten ist, hat sich gezeigt, dass Substrat immobilisiert Gene noch funktionsfähig sind und können transkribiert und übersetzt in RNA und Protein. Gen Bürsten sind für RNA-Polymerasen von Lösung24zugänglich, und die komplexe makromolekulare Mischung der Transkription/Übersetzung ist an der Oberfläche nicht denaturiert. Einer der Vorteile der Immobilisierung von genetischen Komponenten auf einem Substrat ist, dass sie in einem offenen mikrofluidischen Reaktorsystem betrieben werden können, die kontinuierlich zugeführt wird, mit kleinen Vorläufer Moleküle und die Abfallprodukte entfernt25 sein kann , 26.
Kürzlich entwickelten wir eine Variante dieser Methode bezeichnet Bephore (für biokompatible Elektronenstrahl und Fotolack)27, die beruhte ausschließlich auf handelsübliche Komponenten und Sequenz-spezifische DNA-Strang Invasion Reaktionen genutzt die Realisierung eines einfach zu implementierende multistep Lithographie-Verfahrens für die Erstellung von Chip-basierte künstliche Zellen. Eine schematische Übersicht des Verfahrens ist in Abbildung 1dargestellt. Es basiert auf DNA-Haarnadel Moleküle mit einer Photocleavable Gruppe, die auf eine biokompatible PEG-Schicht immobilisiert sind. Photocleavage der Haarnadel stellt eine einsträngige Brückenkopf-Sequenz, durch welche, die DNA Moleküle des Interesses (mit der “verdrängt” DIS-Sequenz) angeschlossenen über Brückenkopf-vermittelten Strang Invasion sein können.
Während Bephore möglicherweise einfacher zu implementieren ist, Daisy erlaubt die Realisierung von sehr dicht und sauber “gen Bürsten”, die in bestimmten Anwendungen Vorteile hat. Im Prinzip könnte aber Daisy und Bephore Lithographie leicht kombiniert werden. Eine verwandte Lithografie Methode nutzen, die DNA-Strang Verschiebung zur Strukturierung von DNA auf Gold Bürsten wurde zuvor von Huang Et Al.entwickelt, aber war nicht im Zusammenhang mit der zellfreien gen Ausdruck28,29eingesetzt.
Im folgenden Protokoll liefern wir Ihnen eine detaillierte Beschreibung der Herstellung von DNA für zellfreie Genexpression mithilfe der Bephore-Methode Bürsten. Wir beschreiben, wie die gen-Chips werden hergestellt und zeigen die Verwendung von mehrstufigen Foto-Lithografie für die räumlich strukturierten Immobilisierung von Genen auf einem Chip. Wir diskutieren auch die Fertigung der Reaktionskammern und die Anwendung der Mikrofluidik für die Erfüllung der auf dem Chip gen Ausdruck Reaktionen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bephore Lithographie ist eine robuste und vielseitige Technik für die gemusterten Immobilisierung von DNA oder RNA. Doch das Verfahren umfasst mehrere Schritte, die – wenn geändert – möglicherweise eine Quelle für Fehler oder Leistung des Systems reduziert.
Ein entscheidender Schritt bei der Herstellung von Bephore-Chips ist die Pegylierung des Substrates, die die Biokompatibilität der Oberfläche bietet. Hier ist die Reinigung Schritt mit einem RCA-Verfahren wichtig, da es auch die Oberf…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir bestätigen dankend finanziellen Unterstützung für dieses Projekt von der Volkswagen-Stiftung (Grant Nr. 89 883) und des European Research Council (Grant Agreement Nr. 694410 – AEDNA). M.S.-S. Unterstützung durch die DFG durch GRK 2062 anerkennt.
Materials
| Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 100 | |
| Silicon wafer (for PDMS master mold) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 76.2 (3”) | |
| Glass slides no. 4 | Menzel | 22 mm x 50 mm | |
| Glass slides no. 1.5 | Assistent | 24 mm x 24 mm | |
| Biotin-PEG-Silane | Laysan Bio | MW 5,000 | |
| Anhydrous toluene | Sigma Aldrich (Merck) | 244511 | |
| Streptavidin | Thermo-Fisher Scientific | S888 | |
| DNA | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | PCR kit |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Spin-column PCR clean-up kit |
| PURExpress | New England Biolabs | E6800S | Cell-free expression system |
| PDMS | Dow Corning | Slygard 184 | |
| FluoSpheres | Thermo-Fisher Scientific | F8771 | |
| PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm) | Bola | S 1810-10 | |
| EpoCore 20 | micro resist technology GmbH | Photoresist | |
| mr-Dev 600 | micro resist technology GmbH | Photoresist developer | |
| Ti-Prime | MicroChemicals | Adhesion promoter | |
| Two-component silicon glue | Picodent | Twinsil | |
| UV-protection yellow foil | Lithoprotect (via MicroChemicals) | Y520E212 | |
| Equipment | |||
| Masks for photolithography | Zitzmann GmbH | 64.000 dpi, 180×240 mm | |
| Upright microscope | Olympus | BX51 | Photolithography and fluorescence imaging |
| 60x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.9 |
| 20x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.5 |
| Camera | Photometrics | Coolsnap HQ | Used with Olympus BX51 |
| Ligtht source | EXFO | X-Cite 120Q | Used with Olympus BX51 |
| Inverted microscope | Nikon | Ti2-E | Fluorescence imaging of gene expression |
| 4x objective | Nikon | CFI P-Apo 4x Lambda | Used with Nikon Ti2-E |
| Camera | Andor | Neo5.5 | Used with Nikon Ti2-E |
| Light source | Lumencor | SOLA SM II | Used with Nikon Ti2-E |
| Cage incubator | Okolab | bold line | Used with Nikon Ti2-E |
| Pressure Controller | Elveflow | OB1 MK3 | |
| NanoPhotometer | Implen | DNA concentration measurement | |
| Plasma cleaner | Diener | Femto | 200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage |
Riferimenti
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