Funksjonell overflaten-immobilisering av gener bruker må Strand forskyvning Litografi
Summary
Vi beskriver en enkel litografisk prosedyre for immobilisering av genet lengde DNA molekyler på en overflate, som kan brukes til å utføre celle-fri gene expression eksperimenter på biochips.
Abstract
Immobilisering av gener på lithographically strukturerte overflater kan studere compartmentalized genet uttrykk prosesser i en åpen microfluidic bioreactor system. I motsetning til andre tilnærminger til kunstig cellulær systemer tillater slikt oppsett en kontinuerlig tilførsel med gene expression reagenser og samtidige drenering av avfallsstoffer. Dette forenkler implementering av celle-fri gene expression prosesser over lengre perioder, som er viktig for realisering av dynamisk genet regulatoriske tilbakemeldingssystemer. Her gir vi en detaljert protokoll for fabrikasjon av genetiske biochips med en enkel-å-bruk litografisk teknikk basert på DNA strand forskyvning reaksjoner, som utelukkende bruker kommersielt tilgjengelige komponenter. Vi tilbyr også en protokoll på integrering av compartmentalized gener med en polydimethylsiloxane (PDMS)-basert microfluidic system. Videre vise vi at systemet er kompatibel med total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi, som kan brukes til direkte observasjon av molekylære interaksjoner mellom DNA og molekyler i uttrykk blanding.
Introduction
Cellen gratis genuttrykk reaksjoner er av stor interesse for ulike applikasjoner i biokjemi, bioteknologi og syntetisk biologi. Celle-frie uttrykk for proteiner var for utarbeidelse av ren protein prøver, som var grunnlaget for flere studier i strukturell biologi. For eksempel ble celle-frie systemer brukt for uttrykket av protein komplekser1 eller membran proteiner2, som er vanskelige å produsere bruker cellebasert uttrykk. Spesielt, celle-gratis genuttrykk reaksjoner ble også brukt til å belyse strukturen i den genetiske koden, starter med den banebrytende eksperimentet ved Nirenberg og Matthaei i 19613.
Nylig har det vært en fornyet interesse i celle-fri metoder i bioteknologi og syntetisk biologi4,5,6. Celle-frie systemer kan utvides med ikke-biologisk forbindelser, og komponentene i ulike biologiske opphavet kombineres lettere7. Selv om celle-frie systemer har den åpenbare ulempen at de ikke “vokse og dele”, er det tenkelig å forberede åpen celle-fri bioreaktorer med grunnleggende metabolske funksjoner og la dem syntetisere metabolitter når enkle karbon og energi innganger8. I det nye feltet på syntetisk biologi lover celle-frie systemer å være en mer forutsigbar “chassis” for implementering av syntetiske biologiske funksjoner.
Foreløpig celle-fri gene expression reaksjoner utføres enten ved hjelp av cellen ekstrakter (fra ulike kilder som bakterier, gjær, insekter), eller transkripsjon/oversettelse systemer som var optimalisert for ulike programmer (f.eks Prokaryotic og eukaryotic genuttrykk, produksjon av membran proteiner, etc.). En populær protokoll for utarbeidelse av bakteriell celle ekstrakt (ofte kalt TXTL) ble levert nylig av V. Noireaux og kolleger9. Egenskapene Biofysiske har vært grundig preget10, og TXTL systemet har allerede brukt klarer å utføre en rekke komplekse biokjemiske oppgaver: f.eks montering av funksjonelle bacteriophages via celle-frie uttrykk phage genomet11, syntese av bakteriell protein filamenter12eller gjennomføringen av celle-fri genet kretser13,14.
Et annet system populært i celle-fri syntetisk biologi er ren systemet, som er rekonstruert fra renset komponenter15,16. Sammenlignet med TXTL systemet, inneholder den ikke nucleases eller protein fornedrelse maskiner. Mens nedbrytning av lineær DNA, RNA molekyler eller proteiner er mindre av et problem i ren systemet, forfall veier er faktisk viktige for gjennomføring av dynamiske funksjoner. For å redusere effekten av exonuclease nedbrytning av lineær genet maler i systemet TXTL (gjennom RecBCD), har end-beskytte GamS protein å bli addert. Både i TXTL og ren systemet er kommersielt tilgjengelig.
Et tema knyttet nært til celle-fri biologi bekymringer studier av effekten av compartmentalization på biokjemiske reaksjoner og ytterligere etableringen av kunstige celle-lignende strukturer eller protocells17,18,19 ,20. Forskning på kunstig celler innebærer vanligvis innkapsling av en biokjemiske reaksjonssystemet i vesicula rom laget av fosfolipider eller andre amphiphiles. Mens slike systemer hjelpe for å utforske grunnleggende aspekter av compartmentalization eller fremveksten av cellularity og selvreproduserende strukturer, de står overfor de typiske problemene på lukkede systemer: i fravær av en fungerende metabolisme og riktig membran transportmekanismer, er det vanskelig å holde compartmentalized reaksjoner kjører for lengre perioder – drivstoff molekyler er oppbrukt og avfallsprodukter akkumulere.
Et interessant alternativ til compartmentalization i slike celle-mimicking rom er romlig organisering av genetisk materiale ved hjelp photolithographic metoder. Immobilisering av “gener på en chip” ble utviklet av Bar-Ziv group ved Weizmann Institute mer enn ti år siden21. Blant de store problemene som måtte løses var uspesifisert opptak av DNA og den potensielle denaturering av proteiner på chip overflaten. Bar-Ziv et al. utviklet en dedikert klima og jordsmonn motstå kalt “Daisy”, som besto av en reaktiv terminal silane for immobilisering av motstå molekyler på silisium dioksid overflater, en lang polyetylenglykol (PEG) spacer som sikret biocompatibility, og en photocleavable headgroup, som ble omgjort til en reaktiv Amin ved bestråling med ultrafiolett (UV) lys. Det har vist at Daisy kan brukes til nakkens genet lengde DNA molekyler (med lengder av flere kilo base-parene (kbp)) på chip underlag. Fra en polymer fysikk synspunkt representerte systemene polymer børster podet på et solid substrat. På grunn av polyelectrolyte natur DNA, er konformasjon av disse børster sterkt påvirket av osmotisk og andre ion-spesifikke effekter22,23.
Viktigst, har det vært vist at substrat-immobilisert gener funksjonelle og kan være transkribert og oversatt til RNA og protein. Gene børster er tilgjengelig for RNA polymerases fra løsning24komplekse macromolecular blanding av transkripsjon/oversettelsen er ikke denaturert på overflaten. En av fordelene ved immobilisering av genetisk komponentene på et substrat er at de kan brukes i et åpent microfluidic reaktoren system som kontinuerlig leveres med små forløper molekyler og fra hvilke avfallsprodukter kan fjernet25 , 26.
Vi har nylig utviklet en variant av denne metoden kalles Bephore (for biokompatible elektronstråle og photoresist)27, som var basert på kommersielt tilgjengelige komponentene og utnyttet sekvens-spesifikke DNA strand invasjonen reaksjoner for realisering av en enkel å implementere må litografi prosedyre for etableringen av chip-baserte kunstig celler. En skjematisk oversikt over prosedyren er vist i figur 1. Den er basert på DNA hårnål molekyler som inneholder en photocleavable-gruppen som er blokkert på et biokompatible PEG-lag. Photocleavage av hårnål viser en enkelt-strandet toehold sekvens, gjennom hvilke DNA molekyler av interesse (inneholder “fortrenger” DIS sekvensen) kan være tilkoblet via toehold-mediert strand invasjon.
Mens Bephore er potensielt enklere å implementere, Daisy gjør at realisering av svært tett og rent “gene børster”, som har fordeler i enkelte programmer. I prinsippet, men kan Daisy og Bephore litografi lett kombineres. En relaterte litografi metoden bruker DNA strand forskyvning for strukturering DNA børster på gull ble utviklet av Huang et al., men ble ikke benyttet i sammenheng med celle-fri gene expression28,29.
I følgende protokollen gir vi en detaljert beskrivelse av produksjonen av DNA børster for celle-fri genuttrykk med metoden Bephore. Beskriver vi hvordan genet chips fremstille og demonstrere bruk av flere trinn Foto-litografi for romlig strukturert immobilisering av gener på en brikke. Vi diskuterer også fabrikasjon av reaksjon kamre og anvendelse av microfluidics for ytelsen på prosessoren gene expression reaksjoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bephore litografi er en robust og allsidig teknikk for den mønstrede immobilisering av DNA eller RNA. Likevel, prosedyren inneholder flere tiltak, som – hvis endret – kan være en kilde for manglende eller redusert ytelse av systemet.
Et viktig skritt i produksjon av Bephore chips er PEGylation av underlaget, som gir biokompatibilitet av overflaten. Her er rengjøringsprosessen med en RCA-prosedyre viktig, siden den også aktiveres overflaten for den påfølgende silanization. Under den fakti…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkjenner takknemlig støtte for dette prosjektet av Volkswagen Stiftung (grant nr 89 883) og europeiske forskningsråd (grant avtalen nummer 694410 – AEDNA). MASTERGRAD-S. erkjenner støtter DFG gjennom GRK 2062.
Materials
| Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 100 | |
| Silicon wafer (for PDMS master mold) | Siegert Wafer | Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 76.2 (3”) | |
| Glass slides no. 4 | Menzel | 22 mm x 50 mm | |
| Glass slides no. 1.5 | Assistent | 24 mm x 24 mm | |
| Biotin-PEG-Silane | Laysan Bio | MW 5,000 | |
| Anhydrous toluene | Sigma Aldrich (Merck) | 244511 | |
| Streptavidin | Thermo-Fisher Scientific | S888 | |
| DNA | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | PCR kit |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Spin-column PCR clean-up kit |
| PURExpress | New England Biolabs | E6800S | Cell-free expression system |
| PDMS | Dow Corning | Slygard 184 | |
| FluoSpheres | Thermo-Fisher Scientific | F8771 | |
| PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm) | Bola | S 1810-10 | |
| EpoCore 20 | micro resist technology GmbH | Photoresist | |
| mr-Dev 600 | micro resist technology GmbH | Photoresist developer | |
| Ti-Prime | MicroChemicals | Adhesion promoter | |
| Two-component silicon glue | Picodent | Twinsil | |
| UV-protection yellow foil | Lithoprotect (via MicroChemicals) | Y520E212 | |
| Equipment | |||
| Masks for photolithography | Zitzmann GmbH | 64.000 dpi, 180×240 mm | |
| Upright microscope | Olympus | BX51 | Photolithography and fluorescence imaging |
| 60x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.9 |
| 20x water immersion objective | Olympus | LumPlanFl | Used with Olympus BX51, NA 0.5 |
| Camera | Photometrics | Coolsnap HQ | Used with Olympus BX51 |
| Ligtht source | EXFO | X-Cite 120Q | Used with Olympus BX51 |
| Inverted microscope | Nikon | Ti2-E | Fluorescence imaging of gene expression |
| 4x objective | Nikon | CFI P-Apo 4x Lambda | Used with Nikon Ti2-E |
| Camera | Andor | Neo5.5 | Used with Nikon Ti2-E |
| Light source | Lumencor | SOLA SM II | Used with Nikon Ti2-E |
| Cage incubator | Okolab | bold line | Used with Nikon Ti2-E |
| Pressure Controller | Elveflow | OB1 MK3 | |
| NanoPhotometer | Implen | DNA concentration measurement | |
| Plasma cleaner | Diener | Femto | 200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage |
Riferimenti
- Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip. Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).
- Jaehme, M., Michel, H. Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins – a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus. The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).
- Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 47, 1588-1602 (1961).
- Harris, D. C., Jewett, M. C. Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 672-678 (2012).
- Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).
- Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
- Estévez-Torres, A., et al. Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (30), 12219-12223 (2009).
- Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance. Nature Communications. 5 (1), 4113 (2014).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. Coarse-Grained Dynamics of Protein Synthesis in a Cell-Free System. Physical Review Letters. 106 (4), 048104 (2011).
- Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction. ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).
- Maeda, Y. T., et al. Assembly of MreB filaments on liposome membranes: a synthetic biology approach. ACS Synthetic Biology. 1 (2), 53-59 (2012).
- Shin, J., Noireaux, V. An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells. ACS Synthetic Biology. 1 (1), 29-41 (2012).
- Niederholtmeyer, H., et al. Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators. eLife. 4, e09771 (2015).
- Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
- Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. Protein synthesis by pure translation systems. Methods. 36 (3), 299-304 (2005).
- Pohorille, A., Deamer, D. Artificial cells: prospects for biotechnology. Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).
- Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
- Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., Leduc, P. Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems. Nature Nanotechnology. 8 (8), 602-608 (2013).
- van Nies, P., et al. Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based synthetic cells. Nature Communications. 9 (1), 1583 (2018).
- Buxboim, A., et al. A single-step photolithographic interface for cell-free gene expression and active biochips. Small. 3 (3), 500-510 (2007).
- Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface. Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).
- Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes. Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).
- Daube, S. S., Bracha, D., Buxboim, A., Bar-Ziv, R. H. Compartmentalization by directional gene expression. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 107 (7), 2836-2841 (2010).
- Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science. 345 (6198), 829-832 (2014).
- Tayar, A. M., Karzbrun, E., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Propagating gene expression fronts in a one-dimensional coupled system of artificial cells. Nature Physics. 11 (12), 1037-1041 (2015).
- Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H., Simmel, F. C. Gene Expression on DNA Biochips Patterned with Strand-Displacement Lithography. Angewandte Chemie-International Edition In English. 57 (17), 4783-4786 (2018).
- Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. Multicolor and Erasable DNA Photolithography. ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).
- Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction. Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).
- McDonald, J. C., et al. Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).
