Questo protocollo fornisce un metodo affidabile per stabilire topi umanizzati sia con il sistema immunitario umano che con le cellule epatiche. I topi immunodeficienti contemporanei ricostituiti ottenuti tramite iniezione intrasplessica di epotociti umani e CD34- cellule staminali ematopoietiche sono suscettibili di infezione da virus immunodeficienza umana-1 e ricapitolano i danni al fegato osservati pazienti affetti da HIV.
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Articolo metodologico
Istituzione del modello murino TK-NOG dualizzato per la patogenesi del fegato associata all'HIV
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nonostante l'aumento dell'aspettativa di vita dei pazienti infettati da virus dell'immunodeficienza umana-1 (HIV-1), la malattia epatica è emersa come una causa comune della loro morbilità. L'immunopatologia epatica causata dall'HIV-1 rimane sfuggente. Piccoli modelli animali di xenotrapianto con epatociti umani e sistema immunitario umano possono ricapitolare la biologia umana della patogenesi della malattia. In questo caso, viene descritto un protocollo per stabilire un modello murino dual eumanizzato attraverso epatociti umani e CD34- trapianto di cellule staminali/progenitrici ematopoietiche (HPG), per studiare l'immunopatologia epatica osservata nei pazienti affetti da HIV. Per ottenere la doppia ricostituzione, il TK-NOG maschile (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg(Alb-TK)7-2/ShiJic) topi sono iniettati intraperitonealmente con ganciclovir (GCV) dosi per eliminare le cellule epatiche transgeniche del topo, e con treosulfan per nonmieloalativi, entrambi i quali facilitare l'innesto di epatociti umani (HEP) e lo sviluppo del sistema immunitario umano (HIS). I livelli di albumina umana (ALB) sono valutati per l'innesto epatico, e la presenza di cellule immunitarie umane nel sangue rilevate dalla citometria di flusso conferma la creazione del sistema immunitario umano. Il modello sviluppato utilizzando il protocollo qui descritto assomiglia a molteplici componenti del danno al fegato da infezione da HIV-1. La sua istituzione potrebbe rivelarsi essenziale per gli studi sulla coinfezione del virus dell'epatite e per la valutazione di farmaci antivirali e antiretrovirali.
Introduzione
Dall'avvento della terapia antiretrovirale, c'è stata una sostanziale diminuzione delle morti legate alla monoinfezione dell'HIV-1. Tuttavia, la malattia epatica è emersa come una causa comune di morbilità nei pazienti affetti da HIV1,2. Le coinfezioni dei virus dell'epatite con infezione da HIV-1 sono più comuni, rappresentando il 10% - 30% delle persone infettate dall'HIV negli Stati Uniti3,4,5.
La specificità ospite dei virus HIV-1 ed epatite limita l'utilità di piccoli modelli animali p....
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Protocollo
Questo protocollo è stato approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Centro Medico dell'Università del Nebraska.
NOT: Ottenere l'approvazione dall'IACUC locale prima di eseguire esperimenti sugli animali.
1. Elaborazione del sangue di cordone ombelicale e isolamento degli HSPC umani
- Eseguire tutte le fasi del protocollo in condizioni sterili negli archivi di flusso laminare.
- Prendere il sangue del cordone ombelicale (CB) raccolto in tubi eparinizzati e rendere il volume fino a 35 mL aggiungendo salina tamponata da fosfati (PBS). Sovrapporre ....
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Risultati
La creazione di un modello murino duale umanizzato con fegato umano e cellule immunitarie può essere facilmente monitorato ad ogni passo con ELISA molto semplice e citometria di flusso, rispettivamente. La citometria di flusso viene eseguita regolarmente per valutare lo sviluppo di un sistema immunitario funzionale e per vedere l'effetto dell'infezione da HIV sulle cellule immunitarie. Nei topi dualizzati, lo sviluppo di cellule immunitarie funzionali può variare dal 15% al 90% della port.......
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Discussione
Il fegato è compromesso e danneggiato nei pazienti affetti da HIV24. Modelli sperimentali di piccoli animali per lo studio delle malattie epatiche umane in presenza di HIV-1 è estremamente limitata, nonostante la disponibilità di alcuni modelli animali cotrapiantati con CD34- HSPC ed epatociti7,12, 25. Negli esperimenti in vitro, gli epatociti hanno dimostrato di avere infezione da HIV-1 di ba.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione dell'Istituto Nazionale di Sanità R24OD018546 (a L.Y.P. e S.G.). Gli autori desiderano ringraziare Weizhe Li, Ph.D., per l'aiuto nelle procedure chirurgiche, Amanda Branch Woods, B.S., Yan Cheng per l'immunohistologia, UNMC flow cytometry ricercatori membri Direttore Phillip Hexley, Ph.D., Victoria B. Smith, B.S., e Samantha Wall, B.S., membri avanzati della struttura di microscopia UNMC Janice A. Taylor, B.S. e James R. Talaska, B.S., per il supporto tecnico. Gli autori riconoscono i dottori Mamoru Ito e Hiroshi Suemizu della CIEA per aver fornito topi TK-NOG e il dr. Joachim Baumgart per la fornitura di treosulfan. G....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 27 aghi G1/2" BD | biosciences | 305109 | |
| aghi 30 G1/2" | BD biosciences | 305106 | |
| 5 mL di polistirene a fondo tondo 12 mm x 75 mm stile | Corning | 352054 | |
| BD 1 mL Siringa di tubercolina senza ago | BD biosciences | 309659 | |
| BD FACS array bioanalyzer | BD Biosciences Per il | controllo della purezza delle cellule CD34+ eluite | |
| BD FACS software di array | BD Biosciences | Software per l'analisi di cellule CD34+ acquisite su array FACS | |
| Vacutainer Tubo di Plastica per la Raccolta del Sangue | BD biosciences | BD 367874 | Per raccogliere il sangue del cordone ombelicale |
| Siero Bovino Albumina | Sigma-aldrich | A9576 | |
| Buprenorfina | Sostanza controllata e antidolorifico | ||
| CD14-PE | BD Biosciences | 555398 | Specifico per l'uomo |
| CD19-BV605 | BD Biosciences | 562653 | Specifico per l'umano |
| CD34 MicroBead Kit, umano | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | Per l'isoazione di CD34+ HSPC |
| CD34-PE, umano | Miltenyi Biotec | 130-081-002 | Anticorpo utilizzato per il controllo della purezza delle cellule CD34+ eluite |
| CD3-AF700 | BD Biosciences | 557943 | Specifico per l'uomo |
| CD45-PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 564105 | Specifico per l'uomo |
| CD4-APC | BD Biosciences | 555349 | Specifico per l'uomo |
| CD8-BV421 | BD Biosciences | 562428 | Specifico per l'uomo |
| Vetrini per il conteggio delle cellule | Bio-rad | 1450015 | |
| ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit | Thermofisher | CS11204 | per l'estrazione del DNA genomico dall'auricolare |
| Cobas Amplicor system v1.5 | Bioanalizzatore | Roche Molecular Diagnostics | |
| Applicatori con punta in cotone | McKesson | 24-106-2S | |
| Citocheratina-18 (CK18) | DAKO | M7010 | Specifico per l'uomo |
| DMSO (Dimetil solfossido) | Sigma-aldrich | D2650-5X5ML | |
| Set di estensione Microbore Slide Clamp(s) Maschio fisso Luer Lock. L: 60 pollici L: 152 cm PV: 0,55 mL Percorso del fluido Sterile | BD biosciences | 30914 | Attaccato al pippet di dispensazione e al carico con sospensione HSPC e HEP |
| FACS Diva versione 6 | Software del citometro a flusso BD Biosciences necessario per l'acquisizione del campione Siero | ||
| Software di analisi per citometria a flusso | |||
| Ganciclovir | APP Pharmaceuticals, Inc. | 315110 | Farmaco di prescrizione |
| Greiner MiniCollect EDTA Tubes | Greiner bio-one | 450475 | |
| Terreno di scongelamento degli epatociti | Laboratori di ricerca Triangle | MCHT50 | |
| Horizon Open Ligating Clip Applicatori | Teleflex | 537061 | Per tenere le clip di legatura |
| Hospira Acqua sterile per iniezione | ACE surgical supply co. Inc. | 001-1187 | Per la diluizione di Buprenorfina (antidolorifico) |
| Set di quantificazione ELISA per albumina umana | Bethyl laboratories | E80-129 | Per la valutazione dei livelli di albumina umana nel siero di topo |
| Laboratori di ricerca sul triangolo | degli epatociti umani | HUCP1 | Epatociti umani crioconservati, qualificati per induzione |
| Forbici per iris, Ted | Pella, Inc. | 13295 | |
| Lancetta | MEDIpoint | Verga d'oro 5 mm | |
| colonne LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Utilizzato per intrappolare CD34+ microsfere (selezione positiva) |
| Terreno di separazione dei linfociti (LSM) | MP Biomedicals | 50494 | Per l'isolamento di linfociti dal sangue periferico |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | contiene il separatore Qudro MACS e le colonne LS |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5605 | Utilizzato per praticare un'incisione sulla pelle per esporre la milza |
| Micro Dissecting Pinze | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5157 | per trattenere ed estrarre la milza dalla cavità peritoneale |
| topo CD45-FITC | BD Biosciences | 553080 | |
| PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) | )Separatore | Qudro SH30256.02 | |
| Qudro | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | contiene quattro colonne LS |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11875093 | |
| StepOne Plus Real Time PCR | Applied Biosystems | Strumento utilizzato per genotipo | |
| Pipetta per dispensazione ripetitiva serie Stepper 1 ml | DYMAX CORP | T15469 | Utilizzato per erogare Suzione HSPC e HEP in modo controllato |
| Suturevet PGA sutura sintetica assorbente | Henry Schein Animal Health | 41178 | Sutura della pelle e del peritoneo |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermofisher scientific | 4369016 | |
| TC20 contatore cellulare automatizzato | Bio-rad | 1450102 | |
| topi TK-NOG | Fornito dall'Istituto Centrale per gli Animali da Sperimentazione (CIEA, Giappone; Dott. Mamoru Ito e Hiroshi Suemizu) | ||
| Treosulfan | Medac GmbH | Fornito da Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) | |
| Trypan Blue | Bio-rad | 1450022 | |
| Micro forbici tipo Vannas, dritte, 80 mm L | Ted Pella, Inc. | 1346 | Utilizzato per praticare un'incisione sulla pelle per esporre la milza |
| Weck emoclip clip tradizionali in titanio Clip di legatura | Esuture | 523700 | Per legare la milza dopo l'iniezione |
Riferimenti
- Smith, C., et al. Factors associated with specific causes of death amongst HIV-positive individuals in the D:A:D Study. AIDS. 24 (10), 1537-1548 (2010).
- Puoti, M., et al. Mortality for liver d....
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