الكشف على أساس الصفائح الدموية من أكسيد النيتريك في الدم عن طريق قياس الفسفرة بسب
Summary
نقدم هنا، وضع بروتوكول لمعالجة الاستخدام المحتمل للصفائح الدموية كجهاز استشعار حساسة للغاية من أكسيد النيتريك في الدم. ويصف إعداد الصفائح الدموية الأولية واستخدام النيتريت وخلايا الدم الحمراء deoxygenated كمولدات أكسيد النيتريك.
Abstract
الصفائح الدموية هي مكونات الدم المسؤولة عن تخثر الدم السليم. وينظم وظيفتها عالية مسارات مختلفة. واحد من أقوى وكلاء فعال في الأوعية، أكسيد النيتريك (لا)، يمكن أن تعمل أيضا كمثبط قوي لتجميع الصفائح الدموية. مباشرة لا الكشف في الدم صعبة للغاية نتيجة لها مفاعليه عال مع الهيموغلوبين الخلية الحرة التي تحد من لا فترة نصف العمر للنطاق ميلي ثانية. حاليا، أي تغييرات بعد تدخلات وتقدر فقط استناداً إلى التغييرات المقاسة والنتريت والنترات (أعضاء المسار الأيضي النترات والنتريت-لا). دقيقة، هذه القياسات يتم بدلاً من ذلك من الصعب تفسير لا تغييرات، بسبب نتريت الأساس الطبيعي عالية مقارنة النسبة الفعلية والنترات مستويات عدة أوامر من حجم أكبر من التغيرات المتوقعة ليس في حد ذاته. ولذلك، تطوير أساليب بسيطة وغير المباشرة التي سوف تسمح بالكشف عن أي مباشرة أمر طال انتظاره. ويعالج هذا البروتوكول استخدام محتمل للصفائح الدموية كدرجة عالية من الحساسية لا جهاز استشعار في الدم. فهو يصف الصفيحات الأولية الغنية البلازما (PRP) والاستعدادات الصفيحات غسلها واستخدام النيتريت وخلايا الدم الحمراء deoxygenated لا المولدات. يستخدم للكشف عن وجود رقم الفسفرة بسب في سيرين 239 (فبسبSer239) حقيقة أن عالية يتم التعبير عن البروتين بسب في الصفائح الدموية وأنه هو فوسفوريلاتيد سريعاً عندما لا يتم هذا يؤدي إلى فرصة فريدة من نوعها لاستخدام هذا المسار للكشف عن وجود لا مباشرة في الدم.
Introduction
الصفائح الدموية هي شظايا خلية صغيرة على شكل قرص المستمدة من ميجاكاريوسيتيس التي حاسمة بالنسبة تخثر الدم. تتالي التخثر هو بدأها مختلف الجزيئات النشطة بيولوجيا (مثل الكولاجين أو ADP)، أفرج عنه بعد إصابة جدار الأوعية الدموية. يمكن تعديل عملية تخثر الدم، بين مختلف المستجيبة بأكسيد النيتريك (لا). لا، بطبيعة الحال التي تنتجها خلايا الثدييات، واحدة من الإشارات الفيزيولوجية الأكثر تنوعاً. أنها بمثابة وعائي قوية والعصبي والمغير المناعي، غيض من فيض مهامها العديدة. في مجرى الدم، كما لا يساعد على تنظيم مدى تخثر الدم عن طريق تثبيط الصفيحات التجميع. أحد المصادر الأكثر احتمالاً لا في مجرى الدم هو النترات، أيون غير عضوية التي ثبت ليكون بمثابة مقدمة لرقم التفاعل مع خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء)، يتم تقليل النيتريت إلى لا وهو تتأكسد ديوكسيهب ميثيموجلوبين (ميثب)1. أي إصدار من كرات الدم الحمراء هو فعال في الأوعية ويسبب فاسوريلاكسيشن2. هذا المسار الحد النتريت بديل لا مسار الجيل، تعمل جنبا إلى جنب مع وتكميل الكلاسيكية لا يوجد مسار جيل ببطانية أكسيد النيتريك synthase في ظروف التاكسج.
الصفائح الدموية نفسها ليست قادرة على تقليل النيتريت في لا ولكن حساسة جداً لوجودها. في الصفائح الدموية سليمة، لا في نانومولار نطاق يزيد المركب (المفوضية الأوروبية50 = 10 نانومتر) والفسفره بسب (المفوضية الأوروبية50 = 0.5 nM)3. ولذلك، قد الصفائح الدموية بمثابة جهاز استشعار ممتازة تخفيض النترات بكرات الدم الحمراء ولا إطلاقها في الدم. وهناك العديد من الأساليب التي يمكن أن تقيس مباشرة مدى تنشيط الصفائح الدموية–مثل أجريجوميتري وثرومبولاستوجرافي (الأرقام)4،5. ومع ذلك، تتطلب هذه الطرق كميات كبيرة بدلاً من المواد والأجهزة المتخصصة باهظة الثمن. وأيضا الممكنة لمراقبة أحداث المصب، بعد لا يتم تحريرها من كرات الدم الحمراء، استخدام التغييرات في التعبير البروتين سطح الصفيحات – مثل سيليكتين ف6. لا كما هو معروف إلى زيادة كمية المركب في الصفائح الدموية7. سابقا، استخدمنا المركب لرصد لا الإفراج في الدم بعد التخفيض نتريت deoxygenated ربك8. وهذا يثبت بطريقة حساسة للغاية؛ ومع ذلك، المركب جزيء لم تدم طويلاً والكشف عنها ينطوي على عمالة مكثفة. هناك إمكانية أخرى، المبينة في البروتوكول المقدم، يستخدم الفسفرة والرمات حفزت وعائي (بسب)-البروتين الكشف عن وجود أي في الدم. بسب هو ركيزة للبروتين كيناز ز التنشيط، الذي هو فوسفوريلاتيد على التفاعل مع أي من خلال المسار المركب sGC/9. يحدث الاكتشاف VASP الفسفرة منخفضة جداً دون أي تركيزات، التي يمكن أن تجعل جهاز كشف حساس جداً لعدم وجود الصفائح الدموية في الدم. وأعرب عن بسب عالية في الصفائح الدموية، ولكن ليس في خلايا الدم الأخرى، مما يسمح لمتابعة الأحداث التي تضم10من الصفائح الدموية بشكل انتقائي.
والهدف الرئيسي من هذا البروتوكول وصف الطريقة بالتفصيل للكشف عن لا الإفراج في الدم كله استخدام تفاعله مع الصفائح الدموية برصد VASP الفسفرة11،12. وصف الأسلوب يسمح الاكتشاف المبكر لانخفاض لا تركيزات-نظرياً في نطاق nanomolar مما يجعل هذا البروتوكول أكثر حساسية من تصميم المركب، نتيجة لاستخدام التقنيات القياسية لطخة غربية يمكن تحقيقها في معظم المختبرات إعدادات.
Protocol
Representative Results
Discussion
حيث يتم تنشيط الصفائح الدموية بسهولة، لطيف معالجة الصفائح الدموية التي تحتوي على عينات مطلوب. وينبغي تجنب بيبيتينج سريعة وقوية تهتز. يمكن استخدام مثبطات الصفائح الدموية مثل بروستاسيكلين (PGI2) لمنع تنشيط الصفائح الدموية؛ ومع ذلك، قد يؤثر هذا على بعض مسارات الإشارات داخل الصفائح الدم?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل بمنحه داخلية المعاهد الوطنية للصحة للدكتور ألن أ. شيشتر.
Materials
| Tri-sodium citrate | Supply by NIH blood bank | ||
| Citric acid | Supply by NIH blood bank | ||
| Glucose | Sigma | G7528-250G | |
| NaCl; sodium chloride | Sigma | S-7653 1kg | |
| NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate | Mallinckrodt Chemical | 7892-04 | |
| KCl; potassium chloride | Mallinckrodt Chemical | 6858 | |
| NaHCO3; sodium bicarbonate | Mallinckrodt Chemical | 7412-12 | |
| HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid] | Sigma | H3375-500g | |
| MgCl2 (1 M); magnesium chloride | Quality Biology | 351-033-721 | |
| CaCl2; calcium chloride | Sigma | C5080-500G | |
| Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles | Nalgene | 2089-0001 | |
| Red septum stopper NO.29 | Fisherbrand | FB57877 | |
| NaNO2–; sodium nitrite | Sigma | S2252-500G | |
| TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane | Sigma | T8524-250G | |
| NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma | 74385-1L | |
| Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
| Phospho-VASP (Ser239) antibody | Cell signaling technology | 3114 | |
| VASP antibody | Cell signaling technology | 3112 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb | Cell signaling technology | 2118 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-6250-10ml | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-035-003 | |
| Clarity Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060-200ml | |
| CO-oximeter (ABL 90 flex) | Radiometer |
Riferimenti
- Huang, K. T., et al. The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry. Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31126-31131 (2005).
- Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).
- Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 26149-26158 (2004).
- Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography. Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).
- Wajih, N., et al. The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose. Redox Biology. 8, 415-421 (2016).
- Akrawinthawong, K., et al. A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 9 (3), e92435 (2014).
- Friebe, A., Koesling, D. Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase. Circulation Research. 93 (2), 96-105 (2003).
- Srihirun, S., et al. Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation. PLoS One. 7 (1), e30380 (2012).
- Smolenski, A., et al. Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody. Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20029-20035 (1998).
- Burkhart, J. M., et al. The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways. Blood. 120 (15), e73-e82 (2012).
- Parakaw, T., et al. Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation. Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).
- Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 13 (3), e0193747 (2018).
- Mal Cortese-Krott, M., et al. Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease. Redox Biology. 14, 328-337 (2018).
- Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets. FEBS letter. 370 (3), 184-188 (1995).
