Blodplater-basert oppdagelsen av nitrogenoksid i blodet ved å måle VASP fosforylering

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å løse potensielle bruk av blodplater som en svært følsom nitrogenoksid sensor i blodet. Det beskriver første Platederivert forberedelse og bruk av nitrite og deoxygenated røde blod celler som nitrogenoksid generatorer.

Abstract

Blodplater er blod komponentene ansvarlig for riktig blodpropp. Deres funksjon er sterkt regulert av ulike veier. En av de mest potente vasoactive agentene, nitrogenoksid (NO), kan også fungere som en kraftig inhibitor av trombocyttaggregasjon. Direkte er ingen oppdagelsen i blodet svært utfordrende på grunn av sin høye kryssreaksjon med celle-fri hemoglobin som begrenser ikke half-life millisekund området. Foreløpig basert ingen endringer etter tiltak er bare beregnet på målt endringer av nitrite og nitrate (medlemmer av nitrat-nitritt-ingen metabolske veien). Men nøyaktig, disse målingene er ganske vanskelig å tolke vis en vis faktiske uten endringer, på grunn av det naturlig høye planlagte nitritt og nitrate høyder som er flere størrelsesordener høyere enn forventede endringene ikke seg selv. Derfor er utviklingen av direkte og enkelt metoder som ville tillate en å oppdage ingen direkte lang forfallen. Denne protokollen adresser en potensiell bruk av blodplater som et ingen sensor i blodet. Det beskriver første Platederivert rik plasma (PRP) og vasket Platederivert forberedelser og bruk av nitrite og deoxygenated røde blod celler som ingen generatorer. Fosforylering av VASP på serine 239 (P-VASP^Ser239) brukes til å oppdage tilstedeværelsen av nr. At VASP protein er svært uttrykt i blodplater og at det er raskt fosforylert når nei finnes fører til en unik mulighet til å bruke denne veien til direkte merker ingen tilstedeværelse i blodet.

Introduction

Blodplater er platen-formet småcellet bruddstykker avledet fra megakaryocytes som er avgjørende for blodpropp. Clotting kaskade startes av ulike bioaktive molekyler (som kollagen eller ADP), utgitt etter skaden av vaskulære veggen. Blodpropp prosessen kan endres, blant ulike effektor av nitrogenoksid (NO). Nei, naturlig produsert av pattedyrceller, er en av de mest allsidige fysiologiske signalene. Det fungerer som en potent vasodilator, nevrotransmitter og immun modulator, for å nevne noen av sine mange funksjoner. I blodet, ikke også bidrar til å regulere omfanget av blodpropp begrenser trombocyttaggregasjon. En av de mest sannsynlig ikke i blodet er nitritt, et uorganiske ion som har vist seg å fungere som en forløper for. Reagerer med røde blodceller (RBCs), nitritt reduseres til Nei og deoxyHb er oksidert til methemoglobin (metHb)¹. INGEN løslatt fra RBCs er vasoactive og forårsaker vasorelaxation². Denne nitritt reduksjon veien er en alternativ ingen generasjon veien, opptrer sammen med og utfyller den klassiske ingen generasjon bane av endothelial nitrogenoksid syntase på hypoxic forhold.

Blodplater seg er ikke kjøpedyktig nedskrive nitritt til nei men er svært følsomme for sin tilstedeværelse. Intakt blodplater, ikke i nanomolar området øker cGMP (EF₅₀ = 10 nM) og fosforylering av VASP (EF₅₀ = 0,5 nM)³. Derfor kan blodplater tjene som en utmerket sensor nitritt reduksjon av RBCs og ingen utslipp til blod. Det finnes flere metoder som direkte kan måle Platederivert aktivisering – som aggregometry og thromboelastography (TEG)^4,5. Men krever metodene dyre spesialiserte instrumentering og ganske store mengder materiale. Det er også mulig å overvåke hendelser nedstrøms, etter nei frigis fra RBCs, bruke endringene i blodplater overflaten protein uttrykk – for eksempel P-selectin⁶. IKKE er også kjent for å øke mengden av cGMP i blodplater⁷. Tidligere brukte vi cGMP overvåke ingen utslipp til blod etter nitritt reduksjon av deoxygenated RBC⁸. Dette viste seg for å være en svært følsom; men cGMP er et kortvarig molekyl og oppdagelsen innebærer omfattende arbeid. En annen mulighet, beskrevet i presentert protokollen, bruker fosforylering i vasodilator-stimulert phospho (VASP)-protein for å oppdage tilstedeværelsen av nei i blodet. VASP er et medium av protein kinase G aktivisering, hvilke er fosforylert på samspill med nei gjennom sGC/cGMP veien⁹. Synlig VASP fosforylering forekommer svært lav uten konsentrasjoner, som kan gjøre blodplater en svært følsom detektor ingen tilstedeværelse i blodet. VASP er svært uttrykt i blodplater, men ikke i andre blod celler, som kan følge selektivt hendelsene som involverer blodplater¹⁰.

Hovedmålet med denne protokollen er å beskrive metoden i detalj for påvisning av ingen utslipp i hele blod med dets interaksjon med blodplater ved å overvåke VASP fosforylering^11,12. Metoden beskrevet oppdages tidlig lav ingen konsentrasjoner – teoretisk sett i området nanomolar, som gjør den nåværende protokollen mer følsom enn cGMP besluttsomhet, på grunn av bruk av standard Western blot teknikker oppnåelig i de fleste laboratorium innstillinger.

Protocol

Merk: Blodprøver ble innhentet fra NIH blod bank (IRB godkjent protokollen: 99-CC-0168). 1. blod prøve forberedelse Merk: For å unngå Platederivert aktivisering, trekke blod sakte og bland forsiktig med citrate ved å snu røret flere ganger. Blodplater-rich plasma (PRP) forberedelse Tegne 30-50 mL blod med en 20 G eller større diameter nål og Legg i et rør som in…

Representative Results

Venøse blodprøver har pO2 verdier mellom 50-80 mmHg. Deoxygenation av helium synker raskt pO2 til 25 mmHg innen 10 minutter økt deoxygenation gang litt videre nedgang pO2. Men økte tiden av deoxygenation fører også til betydelig økte nivåer av celle-fri hemoglobin (bestemmes av co oksymeter, visuelt sett på figur 2 som stadig rød coloration plasma) (Figur 2A-B). Økt hem…

Discussion

Siden blodplater aktiveres lett, forsiktig håndtering av blodplater inneholder eksempler er nødvendig. Rask pipettering og kraftig risting bør unngås. Blodplater-hemmere som prostasyklin (PGI₂) kan brukes til å hindre Platederivert aktivering; Dette kan imidlertid påvirke noen signalveier inne blodplater. For utarbeidelse av blodplater pellets, vi legger til ACD Platederivert suspensjoner og bruker lav hastighet sentrifugering.

Nylagde blodplater i PRP har en levetid span, opp…

Materials

Tri-sodium citrate	Supply by NIH blood bank
Citric acid	Supply by NIH blood bank
Glucose	Sigma	G7528-250G
NaCl; sodium chloride	Sigma	S-7653 1kg
NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate	Mallinckrodt Chemical	7892-04
KCl; potassium chloride	Mallinckrodt Chemical	6858
NaHCO3; sodium bicarbonate	Mallinckrodt Chemical	7412-12
HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid]	Sigma	H3375-500g
MgCl2 (1 M); magnesium chloride	Quality Biology	351-033-721
CaCl2; calcium chloride	Sigma	C5080-500G
Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles	Nalgene	2089-0001
Red septum stopper NO.29	Fisherbrand	FB57877
NaNO2–; sodium nitrite	Sigma	S2252-500G
TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane	Sigma	T8524-250G
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol	Sigma	74385-1L
Protease inhibitor cocktail set III	Calbiochem	539134
Phospho-VASP (Ser239) antibody	Cell signaling technology	3114
VASP antibody	Cell signaling technology	3112
GAPDH (14C10) Rabbit mAb	Cell signaling technology	2118
2-mercaptoethanol	Sigma	M-6250-10ml
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Research Laboratories	111-035-003
Clarity Western ECL Substrate	BIO-RAD	1705060-200ml
CO-oximeter (ABL 90 flex)	Radiometer