Trombocyt-baseret detektion af nitrogenoxid i blodet ved at måle VASP fosforylering
Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at løse den potentielle anvendelse af blodplader som en yderst følsom oxid sensor i blodet. Det beskriver indledende trombocyt udarbejdelse og anvendelse af nitrit og deoxygenated røde blodlegemer som nitrogenoxid generatorer.
Abstract
Blodplader er de ansvarlig for korrekt blodpropper blodkomponenter. Deres funktion er stærkt reguleret af forskellige veje. En af de mest potente vasoaktive agenter, nitrogenoxid (NO), kan også fungere som en kraftig hæmmer af trombocytaggregation. Direkte er ingen opdagelse i blodet meget udfordrende på grund af sin høje reaktivitet med celle-frit hæmoglobin, der begrænser ikke half-life til rækken millisekund. I øjeblikket, baseret ingen ændringer efter interventioner skønnes kun på målte ændringer af nitrit og nitrat (medlemmer af nitrat-nitrit-ingen stofskiftevej). Men præcis, disse målinger er temmelig vanskeligt at fortolke vis en vis faktiske uden ændringer, på grund af den naturligt høje baseline nitrit og nitrat niveauer, der er flere størrelsesordener højere end forventede ændringer af nogen selv. Derfor, udvikling af direkte og enkle metoder, der gør det muligt at påvise NO direkte er længst. Denne protokol adresser en potentiel anvendelse af blodplader som en yderst følsom ingen sensor i blodet. Det beskriver indledende trombocyt rige plasma (PRP) og vasket trombocyt præparater og anvendelse af nitrit og deoxygenated røde blodlegemer som ingen generatorer. Fosforylering af VASP på Serin 239 (P-VASPSer239) bruges til at påvise tilstedeværelsen af nr. Det faktum at VASP protein er stærkt udtrykt i blodplader og at det hurtigt er fosforyleret når ingen er til stede fører til en enestående mulighed for at bruge denne sti til direkte ingen paavisning i blodet.
Introduction
Blodplader er lille disk-formet celle fragmenter stammer fra megakaryocytes, der er afgørende for blodpropper. Den blodpropper kaskade er initieret af forskellige bioaktive molekyler (såsom kollagen eller ADP), udgivet efter skade af vaskulære væg. De blodet til at størkne proces kan ændres blandt forskellige effektorer af nitrogenoxid (NO). Nej, naturligt produceret af pattedyrceller, er en af de mest alsidige fysiologiske signaler. Det fungerer som en potent vasodilatator, neurotransmitter og immun modulator, at nævne et par af dens mange funktioner. I blodbanen, ikke også hjælper med at regulere omfanget af blodpropper ved at hæmme trombocytaggregation. En af de mest sandsynlige kilder til Nej i blodbanen er nitrit, en uorganisk ion, der har vist sig at fungere som en forløber for nr. Reagerer med røde blodlegemer (RBC), nitrit er reduceret til Nej og deoxyHb oxideres til methemoglobin (metHb)1. INGEN frigivet fra røde blodlegemer er vasoaktive og forårsager vasorelaxation2. Denne nitrit reduktion pathway er suppleant ingen generation pathway, handler sammen med og supplere den klassiske ingen generation sti af endotelial nitrogenoxid syntase på hypoksiske betingelser.
Blodplader, selv er ikke i stand til at reducere nitrit i nr men er meget følsomme over for sin tilstedeværelse. I intakt blodplader, ikke i nanomolar vifte øger cGMP (EF50 = 10 nM) og fosforylering af VASP (EF50 = 0,5 nM)3. Derfor, blodplader kan tjene som en fremragende sensor af nitrit reduktion af røde blodlegemer og ingen overgang til blodet. Der er flere metoder, som direkte kan måle omfanget af trombocyt aktivering – såsom aggregometry og thromboelastography (TEG)4,5. Disse metoder kræver dog dyre specialiserede instrumentering og temmelig store mængder af materiale. Det er også muligt at overvåge hændelser downstream, efter nej er frigivet fra RBC, ved hjælp af ændringerne i trombocyttal overflade protein udtryk – såsom P-selectin6. IKKE er også kendt for at øge mængden af cGMP i blodplader7. Tidligere brugte vi cGMP at overvåge ingen overgang til blod efter nitrit reduktion af deoxygenated RBC8. Dette viste sig for at være en meget følsom metode; men cGMP er en kortvarig molekyle og dens afsløring indebærer omfattende arbejdskraft. En anden mulighed, beskrevet i præsenteres protokollen bruger fosforylering af vasodilator-stimuleret phospho (VASP)-protein til at påvise tilstedeværelsen af NO i blodet. VASP er et substrat af protein kinase G aktivisering, hvilke er fosforyleret på samspillet med NO gennem sGC/cGMP vej9. Påviselige VASP fosforylering sker ved meget lav NO koncentrationer, som kunne gøre blodplader en meget følsomme detektor ingen tilstedeværelse i blodet. VASP er stærkt udtrykt i blodplader, men ikke i andre celler, som giver mulighed for at følge selektivt de begivenheder, der involverer blodplader10.
Hovedformålet med denne protokol er at beskrive metoden i detaljer til påvisning af ingen udgivelse i fuldblod med sin interaktion med trombocytter ved overvågning VASP fosforylering11,12. Den beskrevne metode giver tidlig påvisning af lav ingen koncentrationer – teoretisk i nanomolar rækkevidde, hvilket gør denne protokol mere følsomme end cGMP bestemmelse, som følge af brugen af standard vestlige skamplet teknikker opnåeligt i de fleste laboratorium indstillinger.
Protocol
Representative Results
Discussion
Da blodplader nemt aktiveres, skånsom håndtering af trombocyt-holdige prøver er påkrævet. Hurtig pipettering og livlig ryste bør undgås. Trombocyttal hæmmere såsom prostacyclin (BGB2) kan bruges til at forhindre trombocyt aktivering; men dette kan påvirke nogle signaling veje inde blodpladerne. Forberedelse af trombocyt pellets, vi tilføje ACD til trombocyt suspensioner og bruge centrifugering.
Frisklavet blodplader i PRP har en begrænset levetid, levetid, op til 2 h. Fo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af NIH murene tilskud til Dr. Alan N. Schechter.
Materials
| Tri-sodium citrate | Supply by NIH blood bank | ||
| Citric acid | Supply by NIH blood bank | ||
| Glucose | Sigma | G7528-250G | |
| NaCl; sodium chloride | Sigma | S-7653 1kg | |
| NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate | Mallinckrodt Chemical | 7892-04 | |
| KCl; potassium chloride | Mallinckrodt Chemical | 6858 | |
| NaHCO3; sodium bicarbonate | Mallinckrodt Chemical | 7412-12 | |
| HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid] | Sigma | H3375-500g | |
| MgCl2 (1 M); magnesium chloride | Quality Biology | 351-033-721 | |
| CaCl2; calcium chloride | Sigma | C5080-500G | |
| Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles | Nalgene | 2089-0001 | |
| Red septum stopper NO.29 | Fisherbrand | FB57877 | |
| NaNO2–; sodium nitrite | Sigma | S2252-500G | |
| TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane | Sigma | T8524-250G | |
| NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma | 74385-1L | |
| Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
| Phospho-VASP (Ser239) antibody | Cell signaling technology | 3114 | |
| VASP antibody | Cell signaling technology | 3112 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb | Cell signaling technology | 2118 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-6250-10ml | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-035-003 | |
| Clarity Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060-200ml | |
| CO-oximeter (ABL 90 flex) | Radiometer |
Riferimenti
- Huang, K. T., et al. The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry. Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31126-31131 (2005).
- Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).
- Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 26149-26158 (2004).
- Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography. Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).
- Wajih, N., et al. The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose. Redox Biology. 8, 415-421 (2016).
- Akrawinthawong, K., et al. A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 9 (3), e92435 (2014).
- Friebe, A., Koesling, D. Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase. Circulation Research. 93 (2), 96-105 (2003).
- Srihirun, S., et al. Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation. PLoS One. 7 (1), e30380 (2012).
- Smolenski, A., et al. Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody. Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20029-20035 (1998).
- Burkhart, J. M., et al. The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways. Blood. 120 (15), e73-e82 (2012).
- Parakaw, T., et al. Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation. Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).
- Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 13 (3), e0193747 (2018).
- Mal Cortese-Krott, M., et al. Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease. Redox Biology. 14, 328-337 (2018).
- Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets. FEBS letter. 370 (3), 184-188 (1995).
