VASP のリン酸化を測定することによって血液中の一酸化窒素の血小板ベースの検出
Summary
ここでは、血小板の血液で機密性の高い一酸化窒素センサーとしての潜在的な使用に対処するためのプロトコルを提案する.一酸化窒素の発電機としての初期血小板の調製及び亜硝酸と脱酸素化赤血球の使用をについて説明します。
Abstract
血小板は、血液成分の適切な血凝固の責任です。その機能は様々 な経路によって厳しく規制されています。最も強力な血管作動物質、一酸化窒素 (NO) の 1 つは血小板凝集の強力な阻害剤としても機能できます。直接血液の検出はミリ秒の範囲に半減期を制限細胞遊離ヘモグロビンとの高い反応性のために非常に挑戦しません。現在、介入は推定のみ後の変更に基づいて計測された変化亜硝酸、硝酸態窒素 (硝酸亜硝酸イオン NO 代謝経路のメンバー)。ただし正確には、これらの測定値が変更なし、自然に高いベースライン亜硝酸によるヴィザヴィ実際を解釈し、硝酸塩のレベルが桁違いない自身の予想の変更よりも高いはむしろ難しい。したがって、1 つは NO を直接検出する直接、簡単な方法の開発は、長期延滞です。このプロトコルは、血でないセンサー、高感度として血小板の潜在的な使用をアドレスします。発電機なしとして初期多血小板血漿 (PRP) と洗浄血小板製剤や亜硝酸塩と脱酸素化赤血球の使用をについて説明します。VASP の 239 (P VASPSer239) セリンのリン酸化は号の存在を検出するために使用します。血小板の VASP タンパク質を高度に発現がない場合、それは急速にリン酸化があるという事実は、この経路を使用して血のない存在を直接検出するユニークな機会に します。
Introduction
血小板は、血液凝固に不可欠な巨核球から派生した小円盤状細胞の破片です。凝固のカスケードは、血管壁の損傷後にリリース (コラーゲンまたは ADP) など様々 な生理活性物質によって開始されます。一酸化窒素 (NO) によるさまざまなエフェクターの中では、血液の凝固作用を変更できます。いいえ、自然哺乳類細胞で産生されるは、最も汎用的な生体信号の一つです。それは、強力な血管拡張、神経伝達物質、免疫の変調器は、その多くの機能のいくつかの名前として機能します。、血流のないまた血小板凝集を抑制することによって血液凝固の程度を調節するのに役立ちます。血流における NO のほとんどの源の 1 つは亜硝酸、NO の前駆体として示されている無機イオン赤い血球 (赤血球) と反応して、亜硝酸は NO に減り、deoxyHb 酸化されてメトヘモグロビン (metHb)1。赤血球からリリース NO は血管作動性と介する2が発生します。この亜硝酸還元経路一緒に行動し、低酸素状態で内皮の一酸化窒素合成酵素によって古典的な生成パスなしを補完、代替をない生成経路です。
血小板自体に亜硝酸を減らすことができないが、その存在に非常に敏感であります。そのまま血小板でない、ナノモル範囲増加する cGMP (EC50 = 10 nM) と VASP のリン酸化 (EC50 = 0.5 nM)3。したがって、血小板は赤血球と血にないリリースによる亜硝酸還元の優秀なセンサーとして役立つかもしれない。血小板活性化 – aggregometry、トロンボエラストグラフィー (TEG) などの程度を直接測定することができますいくつかの方法があります4,5。ただし、これらのメソッドは高価な専門的な計測と材料のかなり大量に必要です。それはまたイベントを監視することが可能、下流の後から解放される赤血球、血小板の表面タンパク質発現-6P-セレクチン ・ タンパクなどの変更を使用しています。いいえ血小板7で cGMP の量を増やすことも知られています。以前は、cGMP を使用して脱酸素化赤血球8で亜硝酸還元後血液中にリリースを監視にありません。これは、証明には非常に敏感な方法;ただし、cGMP は短寿命分子、その検出は、広範な労力を伴います。別の可能性、提示のプロトコルで説明されている血管拡張刺激リン (VASP) のリン酸化を使用して-血液中の NO の存在を検出するタンパク質。SGC/-cgmp 系9までなしとの相互作用によってリン酸化蛋白質キナーゼ G 活性化の基板です。非常に低いなしで発生するリン酸化 VASP 検出濃度、血小板の血液でない存在の非常に敏感な検出器を作ることができます。VASP は血小板で高発現してが、他の血液細胞のない血小板10事件に従う選択可能します。
このプロトコルの主な目的は、VASP リン酸化11,12を監視することによって血小板との相互作用を使用して全血における NO 放出を検出するための方法について詳細に説明することです。この方法により早期に低濃度 – 理論的に議定書はほとんどの研究室で達成可能な標準的な西部のしみの技術の使用のための cGMP 定量より敏感、ナノモル範囲で設定。
Protocol
Representative Results
Discussion
血小板は、簡単にアクティブ化されるので穏やかな血小板を含む処理のサンプルが必要です。高速ピペッティングおよび活発な動揺は避けるべきであります。プロスタサイクリン (PGI2) などの抗血小板薬は血小板活性化; を防ぐために使用できます。ただし、血小板内のいくつかのシグナル伝達経路に影響可能性があります。血小板ペレットの準備、我々 は血小板の懸濁液に ACD を追?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、Dr アラン N. シェクターに NIH 学内助成金によって賄われていた。
Materials
| Tri-sodium citrate | Supply by NIH blood bank | ||
| Citric acid | Supply by NIH blood bank | ||
| Glucose | Sigma | G7528-250G | |
| NaCl; sodium chloride | Sigma | S-7653 1kg | |
| NaH2PO4; sodium phosphate monobasic, monohydrate | Mallinckrodt Chemical | 7892-04 | |
| KCl; potassium chloride | Mallinckrodt Chemical | 6858 | |
| NaHCO3; sodium bicarbonate | Mallinckrodt Chemical | 7412-12 | |
| HEPES; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[-ethanesulfonic acid] | Sigma | H3375-500g | |
| MgCl2 (1 M); magnesium chloride | Quality Biology | 351-033-721 | |
| CaCl2; calcium chloride | Sigma | C5080-500G | |
| Nalgene Narrow-mouth HDPE Economy bottles | Nalgene | 2089-0001 | |
| Red septum stopper NO.29 | Fisherbrand | FB57877 | |
| NaNO2–; sodium nitrite | Sigma | S2252-500G | |
| TRIZMA Base; Tris[hydroxymethyl]aminomethane | Sigma | T8524-250G | |
| NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma | 74385-1L | |
| Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
| Phospho-VASP (Ser239) antibody | Cell signaling technology | 3114 | |
| VASP antibody | Cell signaling technology | 3112 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb | Cell signaling technology | 2118 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-6250-10ml | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-035-003 | |
| Clarity Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060-200ml | |
| CO-oximeter (ABL 90 flex) | Radiometer |
Riferimenti
- Huang, K. T., et al. The reaction between nitrite and deoxyhemoglobin. Reassessment of reaction kinetics and stoichiometry. Journal of Biological Chemistry. 280 (35), 31126-31131 (2005).
- Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).
- Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway. Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 26149-26158 (2004).
- Park, J. W., Piknova, B., Nghiem, K., Lozier, J. N., Schechter, A. N. Inhibitory effect of nitrite on coagulation processes demonstrated by thromboelastography. Nitric oxide. 40, 45-51 (2014).
- Wajih, N., et al. The role of red blood cell S-nitrosation in nitrite bioactivation and its modulation by leucine and glycose. Redox Biology. 8, 415-421 (2016).
- Akrawinthawong, K., et al. A flow cytometric analysis of the inhibition of platelet reactivity due to nitrite reduction by deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 9 (3), e92435 (2014).
- Friebe, A., Koesling, D. Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase. Circulation Research. 93 (2), 96-105 (2003).
- Srihirun, S., et al. Platelet inhibition by nitrite is dependent on erythrocytes and deoxygenation. PLoS One. 7 (1), e30380 (2012).
- Smolenski, A., et al. Analysis and regulation of vasodilator-stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody. Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20029-20035 (1998).
- Burkhart, J. M., et al. The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways. Blood. 120 (15), e73-e82 (2012).
- Parakaw, T., et al. Platelet inhibition and increased phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein following sodium nitrite inhalation. Nitric oxide. 66, 10-16 (2017).
- Srihirun, S., Piknova, B., Sibmooh, N., Schechter, A. N. Phosphorylated vasodilator-stimulated phosphoprotein (P-VASPSer239) in platelets is increased by nitrite and partially deoxygenated erythrocytes. PLoS One. 13 (3), e0193747 (2018).
- Mal Cortese-Krott, M., et al. Identification of a soluble guanylate cyclase in RBCs: preserved activity in patients with coronary artery disease. Redox Biology. 14, 328-337 (2018).
- Abel, K., Mieskes, G., Walter, U. Dephosphorylation of the focal adhesion protein VASP in vitro and in intact human platelets. FEBS letter. 370 (3), 184-188 (1995).
