Denne protokollen beskriver en microinjection metode som vi har standardisert og brukt i flere år for å levere bestemte mengder nukleinsyrer direkte til hemolymph av mygg og huse fluene. Denne protokollen gir minimal injeksjon dødelighet og lar dose korrelert målinger av fruktbarhet.
Syntetiske dsRNAs, brukes til å indusere RNA-interferens, må dose avhengige fenotypiske effekter. Disse effektene er vanskelig å definere hvis dsRNAs leveres med en ikke-kvantitativ metode. Nøyaktig levering av kjente mengder nukleinsyrer eller andre kjemikalier er viktig å måle effekten av sammensatte testes og tillate pålitelig sammenligning mellom forbindelser.
Her gir vi en reproduserbare, kvantitativ microinjection protokoll som sikrer presis levering av bestemte doser av dsRNA, redusere dødeligheten vanligvis forårsaket av injeksjon skade. Disse endringene inkluderer tillegg av Rhodamine B, en uteksaminert injeksjon nål, og en forbedret gjenopprettingsmetode lånt fra Isoe og Collins. Denne metoden gjør at beregningen av dosen svar og forenkler sammenligninger mellom forbindelser. Versjoner av denne metoden har blitt brukt på 3 planteslekter mygg samt huse fluene for å vurdere reduksjon i fruktbarhet skyldes genet stanse ribosomal RNA transkripsjoner.
Denne protokollen gir strategier for å redusere flere utfordringer av lite insekt microinjection. Sammen, mekanisk levering av dsRNAs ledsaget av visuell bekreftelse, identifikasjon av effektiv steder for levering, og inkludering av en post injeksjon restitusjonsperiode sikre riktig dosering og lav skade dødelighet. Denne protokollen beskriver også en oviposition bioassay for uniform fastsettelse av virkningene på fruktbarhet.
Levere små biomolecules, som nucleic syrer, til voksen dipterans har vist seg for å være utfordrende både store forekomster og fluelarver. Muntlig opptaket av dsRNAs har blitt rapportert å produsere sterilitet (når målretting gener utelukkende uttrykt i testiklene voksne) og dødelighet (når rettet mot SNF7 og en steroid reseptor-coactivator) i larver Aedes aegypti1,2 . Dødelighet er også observert når målretting HSP70 i larver Musca domestica3. Slike fenotypiske effekter, men resultert ikke etter fôring dsRNA til voksne Ae. aegypti i sukker måltider4,5.
Microinjection er brukt til å omgå midttarmen og blir når introdusere patogener eller nucleic syrer, og dermed indusere en systemisk respons5,6,7,8,9,10 . Flere microinjection teknikker finnes, med utstyr fra in-house produsert apparatene som krever visuelle måling av injeksjon volumet Mikroprosessorstyrt sprøytebrukere som tillater automatisk volum levering så lavt som 2.3 nL 5 , 9 , 10 , 11. RNA forstyrrelser (RNAi) utløsere målretting ribosomal mRNAs, forstyrre ovarian utvikling i leddyr så forskjellige som storfe tick Rhipicephalus Micro Plus, myggen Aedes aegypti og Culex pipiens, og huset fly Musca domestica5,9,12,13. I disse studiene var overvåking avbrudd i oviposition avgjørende for å bestemme effekten av inoculant som fenotypen kan manifestere seg som avslutning eller reduksjon av avkom. Dette er en form for multigenerational lethal fenotypen som er en kritisk og ønsket effekt i mange av ikke-tradisjonelle biocontrol metoder som Wolbachia –infisert menn introduksjon (seksuelle inkompatibiliteten) og RNAi indusert sterilitet5 ,9,14. Både dødelighet og fruktbarhet er nødvendig for karakterisere og utvikling av svært spesifikke biorationals (naturlig forekommende patogener og/eller naturlig derivater)15.
Denne protokollen gir detaljert microinjection teknikker for både voksne mygg og huset fluer; en prosess som er ofte ikke godt beskrevet i litteraturen. I tillegg er oviposition bioassay metoder tilstrekkelig vurdere dsRNA effekter på voksen dipterans beskrevet. Disse protokollene ble utviklet spesielt for Aedes aegypti og Musca domestica , men kan endres for andre arter.
Microinjection er en verdifull laboratorium teknikk å sikre levering av dsRNA eller andre biorationals (dvs. plantevernmidler, virus, microsporidia). Mens mange laboratorier utfører microinjection, er nøyaktig hvor injisert ofte uklar på grunn av tekniske begrensninger av levering systemet der leverte volumet ikke direkte målt11. Leverte volum og konsentrasjonen er kritiske parametere at beregningen av standard toksikologiske tiltak som EC50 eller IC50 eller for å definere minimal effektive doser5,16. Dette er spesielt viktig i funksjonelle studier med RNAi i voksen insekter, der levering av fôring ikke alltid resultere i systemisk eksponering for ønsket partikler og faktiske dosen krysset midttarmen og blir er uklart5.
Mens microinjection prosedyren kan være utgangspunktet utfordrende, er rask forbedringer i hastigheten og levering nøyaktighet oppnådd med øvelse og tålmodighet. Mastering injeksjon selve inngrepet er en gang investering, men når oppnådd, prosedyren produserer repeterbare resultater og skade dødelighet av < 3%. Forholdet mellom vellykket injeksjoner vil øke ferdigheter øker tillater injeksjon av 300 mygg eller flyr per dag.
Mange av utfordringene i microinjection er på grunn av nålen brukes. Å bestemme riktig kapillær nål systemavbruddspunkt og tips vinkel er en utfordrende delen av prosedyren og krever litt prøving og feiling for å finne den mest effektive åpning-størrelsen for artene. Fin nålen mest nyttige for mygg microinjection (~ 150 µm) er for små til å levere raskt større volumet injiseres flyr mens derimot større nålen åpning at fungerer på fluer (~ 250 µm) forårsaker omfattende skade til mindre myggen og uakseptabel injeksjon dødelighet. En nål brutt med en butt tupp er ofte vanskelig å komme gjennom cuticle uten skade på vev og økt dødelighet. Insekt skalaer eller vev stykker kan tette nåler i løpet av et eksperiment, så det er ofte nyttig å ha flere nåler trakk hvis erstatning. Vi har funnet at det er enklere å erstatte en vanskelig nål i stedet for å bruke tid på å prøve å fjerne en fast eller fouled nål.
Observere injeksjon løsningen inn insekt er viktig slik at mislykkede injeksjoner kan fjernes (se trinnene 2.14-2,15). Rhodamine B tillegg til injeksjon løsninger gir en klar visuell kald-trinnvis insekter får riktig dosering og er spesielt nyttig mens praktisere (se trinn 2.7).
Injeksjon og oviposition bioassay metodene presenteres her har ble indusert genet knockdown og målbare fenotypiske effekter i voksen Ae. aegypti og M. domestica når bruker dsRNAs designet mot artsspesifikke ribosomal transkripsjoner (Figur 4 og figur 5A). I tillegg evne til denne metoden nøyaktig levere microvolumes til enkeltpersoner tillater dose svar kurver genereres for små mengder av materiale (så lavt som 50 ng; Figur 5B). Dette er spesielt nyttig for metoder som screening siRNAs eller dsRNAs, som produserer store mengder av disse molekylene kan være kostnadseffektive uoverkommelige.
Denne metoden kan endres for å injisere biologiske midler (virus, bakterier, microsporidia) eller kjemiske plantevernmidler, kontroller at noen levering buffere er ufarlige ved injeksjon. Som levering er begrenset av størrelsen på insekt, produsere konsentrert er teste løsninger av betydning.
For å tilstrekkelig vurdere dsRNA effekt, er det nødvendig å spore oviposition som dødelige fenotyper kan kun manifesterer i avkom. Som presenteres her, holder kvinnelige Ae. aegypti separat etter blooding gir individuelle clutch størrelse besluttsomhet og ytterligere testing på de samme individene kan gjøres nedstrøms av oviposition (dvs. gene expression studier, ytterligere gonotrophic sykluser, vev bestemt knockdown) å korrelere reproduktive utgang med andre tiltak som genuttrykk. Som M. domestica generelt oviposit en gruppe svar, er eggende isolert gravid flyr til lå svært arbeidsintensiv og ikke praktisk for mange enkeltpersoner17. Derfor vises en metode for å bestemme gjennomsnittlig clutch størrelse.
Metoden microinjection presenteres her gir konsekvent systemisk levering til mygg og huse fluene. Sammen med dødelighet og oviposition sporing bioassay, kan disse allsidige verktøyene brukes til å vurdere transcriptional og fenotypiske virkningene av små RNA molekyler, biologiske midler og tradisjonelle plantevernmidler der muntlig levering er ikke levedyktig.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Hanayo Arimoto (US Navy), Dana Johnson, Lucy Li og Roxie White (USDA-ARS) for hjelp med datainnsamling og analyse. Vi har også takke Dr. Pia Olafson (USDA-ARS) og Ke Wu (University of Florida) for kritisk gjennomgang av manuskriptet og Niklaus Hostettler (University of Florida) filmingen mikroskop opptakene. Midler ble gitt av USDA, WII – 141C prosjektet marinen og Marine Corps Public Health Center og distribuert krigen jagerfly beskyttelse programmet. Fond ikke hadde noen rolle i design eller retning av studien eller utvikling av manuskriptet.
needle pulling | |||
vertical pipette puller | Kopf | 720 | settings: heater = 15 units, solenoid = 4 amps |
glass capillaries, 3.5" long, ID = 0.530 mm ± 25 μm, OD 1.14 mm | World Precision Instruments | 504949 | capillaries for pulling glass needles |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
microinjector station | |||
Nanoliter 2010 | World Precision Instruments | NANOLITER2010 | microinjector |
manual micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-L | left hand KITE manipulator |
magnetic stand | World Precision Instruments | M9 | holds micromanipulator |
precision stereo zoom binocular microscope on boom stand | World Precision Instruments | PZMIII-BS | dissecting scope for microinjections |
1.5X objective | World Precision Instruments | 501377 | objective for microscope |
light LED ring | World Precision Instruments | 504134 | light ring for injection microscope |
laboratory chill table | BioQuip Products | 1431 | chill table for microinjections |
microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | for staging insects while injections |
Rhodamine B, 98+% | Acros Organics | AC296571000 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
mosquito oviposition bioassays | |||
large Petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | for holding staging slides |
plastic cup – 3 1/2 oz. | Dart Container Corporation | TK35 | mosquito oviposition bioassay cups |
matte tulle fabric | Joanne Fabrics | 1103068 | caps for oviposition bioassays |
blood source | locally acquired | typically bovine or live chickens | |
1 x 30mm clear edible collagen casing | Butcher and Packer | 30D02-05 | |
heavy weight seed germination paper | Anchor Paper Co | SD7615L | |
oral aspirator with HEPA filter | John W. Hock Company | 612 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
house fly oviposition bioassays | |||
4 L plastic food storage canister | Walmart | 555115143 | |
10-inch stockinette sleeve | Medonthego.com | FS15001H | |
wheat bran | locally acquired | typically found at feed stores | |
Calf Manna performance supplement | ValleyVetSupply.com | 16731 | pelleted livestock feed |
dried egg yolk | BulkFoods.com | 40506 | |
black cotton cloth | locally acquired | typically in craft supplies section | |
60 mL cup | Dart Container Corporation | P200-N |