Det här protokollet beskriver en Mikroskop metod som vi har standardiserat och använt i flera år för att leverera vissa mängder nukleinsyror direkt till hemolymph myggor och hus flugor. Detta protokoll resulterar i minimal injektion dödlighet och tillåter dos korrelerade mätningar av fruktsamhet.
Syntetiska dsRNAs, används för att framkalla RNA-interferens, kanske dosen beroende fenotypisk effekter. Dessa effekter är svåra att definiera om dsRNAs levereras med en icke-kvantitativa metod. Korrekt leverans av kända mängder av nucleic syror eller andra kemikalier är kritiska att mäta effekten av den förening som testas och att möjliggöra tillförlitlig jämförelse mellan föreningar.
Här tillhandahåller vi en reproducerbar, kvantitativa Mikroskop protokoll som garanterar korrekt leverans av särskilda doser av dsRNA, minska dödligheten oftast framkallas genom injektion skada. Dessa ändringar inkluderar tillägg av rodamin B, en graderad injektionsnål, och en förbättrad återställningsmetod lånat från Isoe och Collins. Denna metod tillåter beräkning av dos svaren och underlättar jämförelser mellan föreningar. Versioner av denna metod har använts framgångsrikt på tre släkten av myggor samt hus flugor för att bedöma minskningen i fruktsamhet följd nedtystning av ribosomalt RNA avskrifter.
Detta protokoll ger strategier för att minska flera utmaningar för små insekt Mikroskop. Grupp, mekanisk leverans av dsRNAs åtföljs av visuell kontroll, identifiering av effektiva platser för leverans och införandet av en återhämtningsperiod på efter injektion säkerställa korrekt dosering och låg skada dödlighet. Det här protokollet beskriver också en ovipositionen bioassay för enhetlig bestämning av effekter på fruktsamhet.
Att leverera små biomolekyler, såsom nukleinsyror, till vuxna dipterans har visat sig vara utmanande i både Anopheles och husflugor. Oralt intag av dsRNAs har rapporterats att producera sterilitet (när inriktning gener endast uttrycks i testiklarna hos vuxna) och dödlighet (när riktade SNF7 och en steroid receptor coactivator) i larval Aedes aegypti1,2 . Dödligheten har också observerats när inriktning HSP70 i larval Musca domestica3. Sådana fenotypisk effekter, har dock inte resulterade efter utfodring dsRNA till vuxen Ae. aegypti i socker måltider4,5.
Mikroskop har använts för att kringgå midgut vid införandet av patogener eller nukleinsyror, därmed inducera en systemisk reaktion5,6,7,8,9,10 . Finns flera Mikroskop tekniker, som inbegriper utrustning alltifrån internt producerade apparaturar som kräver visuell mätning av injektionsvolymen till mikroprocessorstyrda spridare som möjliggör automatiserad volym leverans så lågt som 2.3 nL 5 , 9 , 10 , 11. RNA interferens (RNAi) utlösare inriktning ribosomal mRNA, störa cystor utveckling i leddjur så olika som boskap fästingen Rhipicephalus microplus, myggen Aedes aegypti och Culex pipiens, och huset flyga Musca domestica5,9,12,13. I dessa studier var övervakning störningar av ovipositionen avgörande för att fastställa effekten av ympmedel som fenotypen kan manifesteras som uppsägning eller minskning av avkomman. Detta är en form av multigenerational dödliga fenotyp som är en kritisk och önskad effekt i många av icke-traditionella Agrilus metoder som Wolbachia –infekterade män introduktion (sexuell inkompatibilitet) och RNAi inducerad sterilitet5 ,9,14. Spåra både dödlighet och fruktsamhet är nödvändiga för att karakterisera och utvecklingen av mycket specifika biorationals (naturligt förekommande patogener eller naturliga derivat)15.
Detta protokoll presenterar detaljerade Mikroskop tekniker för både vuxna myggor och hus flugor; en process som är ofta inte väl beskrivna i litteraturen. Dessutom beskrivs ovipositionen bioassay metoder att på ett adekvat sätt utvärdera dsRNA effekter på vuxna dipterans. Dessa protokoll har utvecklats speciellt för Aedes aegypti och Musca domestica men kan ändras för andra arter.
Mikroskop är en värdefull laboratorium-teknik för att säkerställa leverans av dsRNA eller andra biorationals (dvs. bekämpningsmedel, virus, microsporidia). Medan många laboratorier utföra Mikroskop, är det exakta beloppet som injiceras ofta oklart på grund av tekniska begränsningar av leveranssystem där levererade volymen inte är direkt uppmätta11. Levererad volym och koncentration är kritiska parametrar som tillåter beräkning av toxikologiska standardåtgärder som EC50 eller IC50 eller för att definiera minimala effektiva doser5,16. Detta är särskilt viktigt i funktionella studier med hjälp av RNAi i vuxna insekter, där leverans av utfodring leder inte alltid till systemisk exponering för önskad partiklarna och faktisk dos passerar midgut är oklart5.
Förfarandet för Mikroskop kan vara initialt utmanande, uppnås snabba förbättringar i hastighet och leverans noggrannhet med övning och tålamod. Mastering injektion själva förfarandet är en investering i tid, men, när fulländat, förfarandet ger repeterbara resultat och dödlighet efter skada av < 3%. Förhållandet mellan framgångsrika injektioner kommer att öka kunskaper ökar så att injektion av 300 mygg eller flugor per dag.
Många av utmaningarna i Mikroskop är på grund av nålen används. Att fastställa ordentlig kapillär nål brytpunkt och spets vinkel är ett utmanande aspekt av förfarandet och kräver några försök och misstag att fastställa den mest effektiva öppning storleken för en viss art. En fin nål som är mest användbara för mygga Mikroskop (~ 150 µm) är för liten för att snabbt leverera den större volymen som injiceras i flyger medan däremot större nålen öppning att verk på flugor (~ 250 µm) orsakar omfattande skador skador för mindre myggor och oacceptabla injektion dödlighet. En nål som brutit med en trubbig spets är ofta svårt att få igenom nagelbanden utan vävnadsskada och ökad dödlighet. Insekt skalor eller vävnad bitar kan täppa nålar under loppet av ett experiment, så är det ofta användbart att ha flera nålar drog om byte krävs. Vi har funnit att det är lättare att ersätta en svårt nål i stället för att spendera tid att försöka rensa en fastnat eller sotigt nål.
Att observera injektionslösningen in insekten är kritisk så att misslyckade injektioner kan tas bort (se stegen 2.14-2.15). Rodamin B komplement till injektion lösningar ger en tydlig visuell för att säkerställa att kalla-iscensatt insekter får korrekt dosering och är särskilt användbart samtidigt öva (se steg 2,7).
De metoder för injektion och ovipositionen bioassay som presenteras här har framgångsrikt inducerade genen knockdown och mätbara fenotypisk effekter i vuxen Ae. aegypti och M. domestica när du dsRNAs utformats mot artspecifika ribosomal avskrifter (figur 4 och figur 5A). Dessutom, denna metod förmåga att korrekt leverera microvolumes till individer möjliggör dos-responskurvor ska genereras för små mängder material (så lågt som 50 ng; Figur 5B). Detta är särskilt användbart för metoder såsom screening siRNAs eller dsRNAs, som producerar stora kvantiteter av dessa molekyler kan kostnaden oöverkomliga.
Denna metod kan ändras för att injicera biologiska agens (virus, bakterier, microsporidia) eller kemiska bekämpningsmedel, efter att säkerställa att varje leverans buffertar är ofarlig genom injektion. Leveransvolym begränsas av storleken på insekten, producerar koncentrerad är testa lösningar viktigt.
För att på ett adekvat sätt utvärdera dsRNA effekten, är det nödvändigt att spåra ovipositionen som dödliga fenotyper kan endast manifesteras hos avkomman. Som presenteras här, håller kvinnliga Ae. aegypti separat efter blooding möjliggör bestämning av enskilda koppling storlek och ytterligare tester på samma personer kan göras nedströms ovipositionen (dvs gen uttryck studier, ytterligare gonotrophic cykler, vävnad specifika knockdown) att korrelera reproduktionskapaciteten med andra åtgärder såsom genuttryck. Som M. domestica oviposit allmänt en grupp svar, är anstiftan isolerade dräktig flugor att lägga mycket arbetskraft intensiv och inte praktiskt för ett stort antal individer17. Därför presenteras en metod för att bestämma medelvärdet koppling storlek.
Mikroskop metoden presenteras här ger konsekvent systemisk leverans till myggor och hus flugor. Tillsammans med dödlighet och ovipositionen spårning bioassays, kan dessa mångsidiga verktyg användas för att bedöma transkriptionell och fenotypiska effekterna av små RNA-molekyler, biologiska agens och traditionella bekämpningsmedel där muntliga leverans inte är lönsamt.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Hanayo Arimoto (US Navy), Dana Johnson, Lucy Li och Roxie White (USDA-ARS) för hjälp med datainsamling och analys. Vi tackar också Drs. Pia Olafson (USDA-ARS) och Ke Wu (University of Florida) för kritisk granskning av manuskript och Niklaus Hostettler (University of Florida) för filmning Mikroskop filmen. Finansieringen tillhandahölls av USDA, WII – 141C projektet av marinen och Marine Corps Public Health Center och programmet distribuerat War Fighters-skydd. Finansiärerna hade ingen roll i design eller utveckling av manuskript eller riktning av studien.
needle pulling | |||
vertical pipette puller | Kopf | 720 | settings: heater = 15 units, solenoid = 4 amps |
glass capillaries, 3.5" long, ID = 0.530 mm ± 25 μm, OD 1.14 mm | World Precision Instruments | 504949 | capillaries for pulling glass needles |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
microinjector station | |||
Nanoliter 2010 | World Precision Instruments | NANOLITER2010 | microinjector |
manual micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-L | left hand KITE manipulator |
magnetic stand | World Precision Instruments | M9 | holds micromanipulator |
precision stereo zoom binocular microscope on boom stand | World Precision Instruments | PZMIII-BS | dissecting scope for microinjections |
1.5X objective | World Precision Instruments | 501377 | objective for microscope |
light LED ring | World Precision Instruments | 504134 | light ring for injection microscope |
laboratory chill table | BioQuip Products | 1431 | chill table for microinjections |
microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | for staging insects while injections |
Rhodamine B, 98+% | Acros Organics | AC296571000 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
mosquito oviposition bioassays | |||
large Petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | for holding staging slides |
plastic cup – 3 1/2 oz. | Dart Container Corporation | TK35 | mosquito oviposition bioassay cups |
matte tulle fabric | Joanne Fabrics | 1103068 | caps for oviposition bioassays |
blood source | locally acquired | typically bovine or live chickens | |
1 x 30mm clear edible collagen casing | Butcher and Packer | 30D02-05 | |
heavy weight seed germination paper | Anchor Paper Co | SD7615L | |
oral aspirator with HEPA filter | John W. Hock Company | 612 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
house fly oviposition bioassays | |||
4 L plastic food storage canister | Walmart | 555115143 | |
10-inch stockinette sleeve | Medonthego.com | FS15001H | |
wheat bran | locally acquired | typically found at feed stores | |
Calf Manna performance supplement | ValleyVetSupply.com | 16731 | pelleted livestock feed |
dried egg yolk | BulkFoods.com | 40506 | |
black cotton cloth | locally acquired | typically in craft supplies section | |
60 mL cup | Dart Container Corporation | P200-N |