रोबोट प्रणालियों का उपयोग करने के लिए प्रक्रिया और ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण के लिए बृहदांत्र Murine नमूने एंबेड
Summary
murine ऊतक प्रसंस्करण के लिए मानकीकरण की कमी के रूप में मानव नमूनों की तुलना में murine histopathological विश्लेषण की गुणवत्ता कम कर देता है । यहां, हम murine सूजन और uninflamed बृहदांत्र ऊतकों की histopathological परीक्षा प्रदर्शन करने के लिए नियमित रूप से प्रसंस्करण और मानव नमूनों embedding के लिए इस्तेमाल किया रोबोट प्रणालियों की व्यवहार्यता दिखाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।
Abstract
मानव रोगों की समझ बहुत पशु मॉडलों के अध्ययन के लिए धंयवाद विस्तार किया गया है । बहरहाल, प्रयोगात्मक मॉडल के histopathological मूल्यांकन के रूप में कठोर है कि मानव नमूनों के लिए आवेदन के रूप में की जरूरत है । दरअसल, विश्वसनीय और सटीक निष्कर्ष ड्राइंग गंभीर रूप से ऊतक अनुभाग तैयारी की गुणवत्ता से प्रभावित है । यहां, हम murine ऊतकों के histopathological विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है कि प्रक्रिया के दौरान कई स्वचालित कदम लागू करता है, प्रारंभिक तैयारी से murine नमूनों की आयल embedding के लिए । स्वचालित प्रक्रियाओं से कठोर प्रोटोकॉल मानकीकरण के माध्यम से methodological चर की कमी murine रोग विश्लेषण की समग्र विश्वसनीयता में वृद्धि करने के लिए योगदान देता है । विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल स्वचालित प्रसंस्करण और एंबेडिंग रोबोट प्रणालियों के उपयोग का वर्णन, नियमित रूप से ऊतक प्रसंस्करण और मानव नमूनों की आयल embedding के लिए इस्तेमाल किया, आंतों की सूजन के murine नमूनों की प्रक्रिया । हम निष्कर्ष है कि murine ऊतकों की histopathological परीक्षा की विश्वसनीयता मानकीकृत और स्वचालित तकनीक की शुरूआत पर काफी बढ़ जाती है ।
Introduction
पिछले दशकों में, कई प्रयोगात्मक मॉडल मानव रोगों के लिए अग्रणी रोगजनक तंत्र काटना करने के लिए विकसित किया गया है1,2. आदेश में एक रोग की गंभीरता का आकलन करने के लिए, शोधकर्ताओं ने एक इलाज के प्रभाव का मूल्यांकन करना होगा और कोशिकाविज्ञान और ऊतकवैज्ञानिक स्थापत्य विविधताओं या सूजन की मात्रा3का अध्ययन । उन प्रयोगात्मक मॉडल पर प्रदर्शन करने के लिए, विस्तृत histopathological विश्लेषण की जरूरत है, अक्सर murine और मानव नमूने की तुलना4,5.
इसके अतिरिक्त, मानव नमूने सामांयतः संसाधित और मानकीकृत histopathological मानदंड और तरीकों के माध्यम से histopathology कोर सुविधाओं और अनुभवी मानव पैथोलॉजिस्ट द्वारा बनाए गए हैं । इसके विपरीत, murine ऊतकों आमतौर पर तय कर रहे हैं, एंबेडेड और histopathological प्रोटोकॉल के सीमित अनुभव के साथ शोधकर्ताओं ने विश्लेषण किया । गुणवत्ता और histopathological परीक्षा की विश्वसनीयता उच्च गुणवत्ता वाले ऊतक वर्गों की तैयारी के साथ शुरू होता है । कई कारकों समीक्षकों को बढ़ाने या निर्धारण, macroscopic अनुभाग, प्रसंस्करण, आयल embedding, और6,7के embedding सहित अंतिम विश्लेषण की गुणवत्ता में कमी करने के लिए योगदान करते हैं ।
नमूने के हेरफेर को शामिल इन सभी अंश मैनुअल त्रुटियों के अधीन हैं, नमूनों की मैनुअल embedding सहित और, एक हद तक कम करने के लिए, मैनुअल microtome अनुभाग और धुंधला । वर्तमान में, ऊतकवैज्ञानिक मूल्यांकन के लिए murine ऊतक तैयार करने की पूरी प्रक्रिया प्रोटोकॉल है कि प्रयोगशाला से प्रयोगशाला और मैनुअल प्रोटोकॉल के लिए बदलती है पर निर्भर करता है । इस अध्ययन का लक्ष्य murine histopathological परीक्षा में त्रुटियों और परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए मानकीकृत स्वचालित प्रोटोकॉल को लागू करने के लिए है ।
हमारे ज्ञान के लिए, हम यहां पूरी तरह से स्वचालित ऊतक प्रसंस्करण और murine ऊतकों के ऊतकवैज्ञानिक मूल्यांकन के लिए embedding के लिए पहली प्रोटोकॉल का वर्णन; मानव नमूनों के विश्लेषण के लिए इन पैथोलॉजी इकाइयों में नियमित रूप से उपयोग किया जाता है । विधि की व्यवहार्यता का एक व्यावहारिक उदाहरण के रूप में, आंतों की सूजन का एक murine मॉडल का विश्लेषण किया गया है, यानी, जीर्ण कोलाइटिस मॉडल पीने के पानी में dextran सोडियम सल्फेट (DSS) के दोहराया प्रशासन की वजह से8 ,9. इस प्रयोगात्मक सेटिंग बारीकी से मानव भड़काऊ आंत्र रोगों (आईबीडी)10 के बाद से जैसा दिखता है DSS-इलाज जानवरों आंतों की सूजन के लक्षण प्रदर्शन, जैसे, वजन घटाने, ढीला मल या दस्त, और बृहदांत्र के साथ ही फाइब्रोसिस का छोटा 8,9,11. के रूप में मानव आईबीडी रोगियों के लिए मनाया, DSS उपचार एक जटिल रोग पाठ्यक्रम उत्पन्न करता है । इस संदर्भ में, विस्तृत ऊतकवैज्ञानिक मूल्यांकन ऊतक वास्तुकला के गहन परिवर्तन को समझने के लिए आवश्यक हैं । इस प्रकार, नमूना तैयारी की गुणवत्ता में वृद्धि के लिए वर्णित प्रोटोकॉल का कार्यांवयन murine प्रयोगात्मक सेटिंग्स के लिए ऊतकवैज्ञानिक और immunohistochemical विश्लेषण की व्याख्या पर निर्भर शोधकर्ताओं को लाभ हो सकता है । Murine मानव रोगों के प्रयोगात्मक मॉडल ऊतक वास्तुकला के परिवर्तन शामिल, सेलुलर ऊतक घुसपैठ या विभिन्न ऊतकों और अंगों में सूजन की उपस्थिति (आंत, मस्तिष्क, जिगर, त्वचा) की वृद्धि की गुणवत्ता का उपयोग कर सकते histopathological परीक्षा के लिए सैंपल तैयार ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम histopathologic विश्लेषण के लिए murine ऊतकों की तैयारी के दौरान अलग स्वचालित कदम का उपयोग । इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य तकनीकी संकेत प्रदान करने के लिए reproducibility और पूरी प्रक्रिया के मानकीकरण बढ़ाने के लिए, इस प्रकार अं?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम IRCCS Policlinico अस्पताल के पैथोलॉजी विभाग, तकनीकी सहायता के लिए मिलान और पशुपालन में सहायता के लिए िीईओ पशु सुविधा का धंयवाद ।
Materials
| Absolute Ethanol anhydrous | Carlo Erba | 414605 | reagent |
| Absolute ETOH | Honeywell | 02860-1L | reagent |
| Aluminium Potassium Sulfate | SIGMA | A6435 | reagent |
| Aniline Blue | SIGMA | 415049 | reagent |
| carbol Fuchsin | SIGMA | C4165 | reagent |
| CD11b (clone M1/70) | TONBO biosciences | 35-0112-U100 | antibody |
| CD20 IHC (clone SA275A11) | Biolegend | 150403 | antibody |
| CD3 (17A2) | TONBO biosciences | 35-0032-U100 | antibody |
| CD4 (GK1.5) | BD Biosciences | 552051 | antibody |
| CD45.2 (clone 104) | BioLegend | 109837 | antibody |
| CD8 (53-6.7) | BD Biosciences | 553031 | antibody |
| Citrate Buffer pH 6 10X | SIGMA | C9999 | reagent |
| Dab | Vector Laboratories | SK-4100 | reagent |
| DPBS 1X | Microgem | L0615-500 | reagent |
| DSS | TdB Consultancy | DB001 | reagent |
| EDTA | SIGMA | E9884 | reagent |
| EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex Substrate | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex/HRP | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex+ Rat Linker | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| Eosin | VWR | 1.09844 | reagent |
| F4/80 (clone BM8) | BioLegend | 123108 | antibody |
| Formalin | PanReac | 2,529,311,215 | reagent |
| glacial acetic acid | SIGMA | 71251 | reagent |
| Goat-anti-Rat-HRP | Agilent DAKO | P0448 | antibody |
| Haematoxylin | DIAPATH | C0303 | reagent |
| LEICA Rotary microtome (RM2255) | Leica | RM2255 | equipment |
| Ly6g (clone 1A8) | BD Biosciences | 551459 | antibody |
| Mercury II Oxide | SIGMA | 203793 | reagent |
| Omnis Clearify Clearing Agent | DAKO | CACLEGAL | reagent |
| Omnis EnVision Flex TRS | DAKO | GV80011-2 | reagent |
| Orange G | SIGMA | O3756 | reagent |
| Paraffin | Sakura | 7052 | reagent |
| Peloris | LEICA | equipment | |
| Percoll | SIGMA | P4937 | reagent |
| RPMI 1640 without L-Glutamine | Microgem | L0501-500 | reagent |
| STS020 | Leica | equipment | |
| Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette | SAKURA | 7022 | equipment |
| Tissue-Tek Automated paraffin embedder | Sakura | equipment | |
| Xylene | J.T.Baker | 8080.1000 | reagent |
Riferimenti
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- Olivier, A. K., et al. Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory. Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).
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