Verwendung von Robotersystemen zu verarbeiten und Embed-Kolon Murine Proben für histologische Analysen
Summary
Fehlende Standardisierung für murine Gewebe Verarbeitung reduziert die Qualität der murinen histopathologische Analyse im Vergleich zu menschlichen Exemplare. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur histopathologischen Untersuchung der murinen entzündet und uninflamed Kolon Gewebe auf die Machbarkeit von Robotersystemen routinemäßig verwendet für die Verarbeitung und Einbettung von humanen Proben durchführen.
Abstract
Das Verständnis der menschlichen Krankheiten wurde durch die Studie von Tiermodellen stark ausgebaut. Histopathologische Beurteilung der experimentellen Modellen muss allerdings so streng wie die Humanproben angemeldete sein. In der Tat, ist zuverlässig und präzise Schlussfolgerungen kritisch die Qualität des Gewebes Abschnitt Vorbereitung beeinflusst. Hier beschreiben wir ein Protokoll für histopathologische Analyse der murinen Geweben, die mehrere automatisierte Schritte während des Verfahrens, von der anfänglichen Vorbereitung zur Paraffin Einbettung der murinen Proben implementiert. Die Reduzierung der methodischen Variablen durch strengen Protokoll Standardisierung von automatisierten Verfahren trägt zur erhöhten Zuverlässigkeit der murinen pathologische Analyse. Insbesondere dieses Protokoll beschreibt die Nutzung der automatischen Verarbeitung und Einbettung Robotersysteme, routinemäßig für die Gewebe-Verarbeitung und Paraffin Einbetten von humanen Proben zur murine Proben von Darmentzündungen zu verarbeiten. Wir schlussfolgern, dass die Zuverlässigkeit der histopathologischen Untersuchung der murinen Gewebe mit der Einführung des standardisierten und automatisierten Techniken deutlich erhöht wird.
Introduction
In den letzten Jahrzehnten wurden mehrere experimentelle Modelle entwickelt, um die pathogenen Mechanismen führen zu Krankheiten beim Menschen1,2zu sezieren. Bei der Beurteilung die schwere einer Krankheit müssen Forscher bewerten die Wirkung einer Behandlung und der zytologischen und histologischen architektonische Variationen oder die Höhe der Entzündung3zu studieren. Um auf diesen experimentellen Modellen durchzuführen, sind detaillierte histopathologische Analysen nötig, oft vergleichen murinen und menschlichen Proben4,5.
Darüber hinaus Humanproben häufig verarbeitet und erzielte durch Histopathologie Kern Einrichtungen und erfahrenen menschlichen Pathologen durch standardisierte histopathologischen Kriterien und Methoden. Umgekehrt werden murinen Gewebe in der Regel behoben, eingebettet und von Forschern mit begrenzter Erfahrung der histopathologischen Protokolle analysiert. Die Qualität und Zuverlässigkeit der histopathologischen Untersuchung beginnt mit der Vorbereitung der qualitativ hochwertigen Gewebeschnitten. Mehrere Faktoren tragen kritisch zu erhöhen oder verringern die Qualität der endgültigen Analyse, einschließlich Fixierung, makroskopischen Schnitt, Verarbeitung, paraffin einbetten und Einbettung der Proben6,7.
Alle diese Stellen mit Manipulation der Probe werden manuelle Fehler, einschließlich manueller Einbettung der Proben und, in geringerem Maße, manuelle Mikrotom schneiden und Färbung unterzogen. Derzeit setzt der gesamte Prozess der murinen Gewebe Vorbereitung für histologische Auswertung auf Protokolle, die von Labor zu Labor variieren und manuelle Protokolle. Das Ziel dieser Studie ist es, standardisierte automatisierten Protokolle zur Reduzierung von Fehlern und Variabilität in murinen histopathologische Untersuchung zu implementieren.
Nach unserem Kenntnisstand beschreiben wir hier die ersten Protokolle für vollautomatische Gewebe Verarbeitung und für die histologische Auswertung der murinen Gewebe einbetten; Diese werden routinemäßig in Pathologie Einheiten für die Analysen der menschlichen Proben verwendet. Als ein praktisches Beispiel für die Durchführbarkeit der Methode ein Mausmodell der Darmentzündung wurde analysiert, d. h., das Modell chronischer Kolitis verursacht durch wiederholte Gabe von Dextran Natriumsulfat (DSS) in der Trinkwasser-8 ,9. Diese experimentelle Einstellung eng ähnelt menschlichen entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) Krankheiten10 da DSS-behandelten Tieren Anzeichen einer Darmentzündung, z. B. Gewichtsverlust, weichem Stuhl oder Durchfall und Verkürzung der Doppelpunkt und die Fibrose aufweisen 8,9,11. Wie für menschliche IBD-Patienten beobachtet, erzeugt DSS Behandlung eine komplexe Krankheitsverlauf. In diesem Zusammenhang sind aufwendige histologische Auswertungen erforderlich, die tiefgreifende Veränderung die Gewebearchitektur verstehen. Damit die Umsetzung der beschriebenen Protokolle zur Steigerung der Probenqualität Vorbereitung könnten Forscher unter Berufung auf die Interpretation der histologischen profitieren und immunhistochemische Analysen für murine experimentelle Einstellungen. Murinen experimentelle Modelle menschlicher Erkrankungen mit Veränderungen der Gewebearchitektur, das Vorhandensein von Zellgewebe infiltrieren oder Entzündungen in verschiedenen Geweben und Organe (Darm, Gehirn, Leber, Haut) können die erhöhte Qualität der Probenvorbereitung für die histopathologische Untersuchung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir nutzen verschiedene automatisierte Schritte bei der Vorbereitung der murinen Gewebe zur histologischen Analyse. Dieses Protokoll bezweckt die Erbringung von technischen Hinweise um die Reproduzierbarkeit und die Standardisierung des gesamten Prozesses, wodurch die Gesamtqualität der histopathologischen Abschlussbewertung zu steigern. Wir realisiert automatisierte Instrumente und Methoden für die Vorbereitung und Einbettung von Geweben, routinemäßig in Pathologie Kern Anlagen für die Erforschung der menschlichen …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken der Abteilung für Pathologie Klinikum IRCCS Poliklinik, Mailand für den technischen Support, IEO Animal Facility für Unterstützung in der Tierhaltung.
Materials
| Absolute Ethanol anhydrous | Carlo Erba | 414605 | reagent |
| Absolute ETOH | Honeywell | 02860-1L | reagent |
| Aluminium Potassium Sulfate | SIGMA | A6435 | reagent |
| Aniline Blue | SIGMA | 415049 | reagent |
| carbol Fuchsin | SIGMA | C4165 | reagent |
| CD11b (clone M1/70) | TONBO biosciences | 35-0112-U100 | antibody |
| CD20 IHC (clone SA275A11) | Biolegend | 150403 | antibody |
| CD3 (17A2) | TONBO biosciences | 35-0032-U100 | antibody |
| CD4 (GK1.5) | BD Biosciences | 552051 | antibody |
| CD45.2 (clone 104) | BioLegend | 109837 | antibody |
| CD8 (53-6.7) | BD Biosciences | 553031 | antibody |
| Citrate Buffer pH 6 10X | SIGMA | C9999 | reagent |
| Dab | Vector Laboratories | SK-4100 | reagent |
| DPBS 1X | Microgem | L0615-500 | reagent |
| DSS | TdB Consultancy | DB001 | reagent |
| EDTA | SIGMA | E9884 | reagent |
| EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex Substrate | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex/HRP | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex+ Rat Linker | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| Eosin | VWR | 1.09844 | reagent |
| F4/80 (clone BM8) | BioLegend | 123108 | antibody |
| Formalin | PanReac | 2,529,311,215 | reagent |
| glacial acetic acid | SIGMA | 71251 | reagent |
| Goat-anti-Rat-HRP | Agilent DAKO | P0448 | antibody |
| Haematoxylin | DIAPATH | C0303 | reagent |
| LEICA Rotary microtome (RM2255) | Leica | RM2255 | equipment |
| Ly6g (clone 1A8) | BD Biosciences | 551459 | antibody |
| Mercury II Oxide | SIGMA | 203793 | reagent |
| Omnis Clearify Clearing Agent | DAKO | CACLEGAL | reagent |
| Omnis EnVision Flex TRS | DAKO | GV80011-2 | reagent |
| Orange G | SIGMA | O3756 | reagent |
| Paraffin | Sakura | 7052 | reagent |
| Peloris | LEICA | equipment | |
| Percoll | SIGMA | P4937 | reagent |
| RPMI 1640 without L-Glutamine | Microgem | L0501-500 | reagent |
| STS020 | Leica | equipment | |
| Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette | SAKURA | 7022 | equipment |
| Tissue-Tek Automated paraffin embedder | Sakura | equipment | |
| Xylene | J.T.Baker | 8080.1000 | reagent |
Riferimenti
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- Olivier, A. K., et al. Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory. Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).
- Gibson-Corley, K. N., Olivier, A. K., Meyerholz, D. K. Principles for valid histopathologic scoring in research. Veterinary pathology. 50, 1007-1015 (2013).
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- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
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- Cribiù, F. M., Burrello, C., et al. Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis. European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).
