Bruker Robotic systemer til å behandle og legge Colonic Murine prøver for histologiske analyser
Summary
Mangelen på standardisering for murine vev behandling reduserer kvaliteten på murine histopathological analyse i forhold til menneske prøver. Her presenterer vi en protokoll for å utføre histopatologisk undersøkelse av murine betente og uninflamed colonic vev å vise muligheten for robotic systemer rutinemessig brukes for behandling og innebygging prøver fra mennesker.
Abstract
Forståelsen av menneskelige sykdommer er blitt betydelig utvidet takk til studiet av dyremodeller. Likevel må histopathological evaluering av eksperimentelle modeller være så strenge som brukes for menneskelig prøver. Faktisk er trekke pålitelig og nøyaktig konklusjoner kritisk påvirket av kvaliteten på vev delen forberedelse. Her beskriver vi en protokoll for histopathological analyse av murine vev som implementerer flere automatiserte trinn under prosedyren, fra innledende forberedelse til parafin innebygging av murine prøvene. Reduksjon av metodologiske variabler gjennom strenge protokollen standardisering fra automatisert prosedyrer bidrar til generelle påliteligheten av murine patologisk analyse. Spesielt denne protokollen beskriver bruken av automatiserte behandling og innebygging robotic systemer, rutinemessig brukes for vev behandling og parafin innebygging av prøver fra mennesker, behandle murine eksemplarer av intestinal betennelser. Vi konkludere med at påliteligheten av histopatologisk undersøkelse av murine vev er betydelig økt ved innføring av standardiserte og automatisert teknikker.
Introduction
I de siste tiårene, er flere eksperimentelle modeller utviklet for å analysere patogene mekanismer fører til menneskelige sykdommer1,2. For å vurdere alvorlighetsgraden av en sykdommen, må forskere evaluere effekten av behandling og studere fargemaskin og histologiske arkitektoniske variasjoner eller mengden av betennelse3. Du kan utføre på disse eksperimentelle modeller, er detaljerte histopathological analyser nødvendig, ofte sammenligne murine og menneskelige4,5.
Dessuten prøver fra mennesker vanligvis behandles og scoret av histopatologi kjernen fasiliteter og erfarne menneskelige patologer gjennom standardisert histopathological kriterier og metoder. Derimot er murine vev vanligvis fast, innebygd og analysert av forskere rydding av histopathological protokoller. Kvaliteten og påliteligheten av histopathological eksamen begynner med utarbeidelse av høy kvalitet vev deler. Flere faktorer bidrar kritisk å forhøye eller nedgang kvaliteten på den endelige analysen, inkludert fiksering, makroskopisk skjæring, behandling, parafinen innebygging og innebygging av prøver6,7.
Alle disse passasjene som involverer manipulering av prøven er utsatt for manuelle feil, inkludert manuell innebygging av prøvene og, i mindre grad, manuell mikrotomen snitting og flekker. I dag bruker hele prosessen med murine vev forberedelse til histologiske evaluering protokoller som varierer fra laboratoriet til laboratoriet og manuell protokoller. Målet med denne studien er å implementere standardiserte automatisert protokoller for å redusere feil og variasjon i murine histopathological eksamen.
Vi vet beskriver vi her første protokollene for helautomatisk vev behandling og innebygging av histologiske evalueringen av murine vev; disse brukes rutinemessig i patologi enheter for analyser av menneskelig. Som et praktisk eksempel på muligheten for metoden, en murine modell av intestinale betennelsen er analysert, i.e., kronisk kolitt modellen skyldes gjentatt utfylling av dekstran natrium sulfat (DSS) i drikkevann8 ,9. Denne eksperimentelle innstillingen tett ligner menneskelige inflammatorisk tarm sykdommer (IBD)10 siden DSS-behandlede dyr forevise underskriver av intestinal betennelser, f.eks vekttap, løs mage eller diaré og forkorte den kolon samt fibrose 8,9,11. Som observert i menneskelige IBD pasienter, genererer DSS behandling et komplisert sykdom kurs. I denne sammenheng må forseggjort histologiske evalueringer forstå dyptgripende endring av vev arkitektur. Dermed gjennomføringen av beskrevet protokoller for å øke eksempel forberedelse kvalitet kan ha nytte forskere avhengig tolkning av histologiske og immunohistochemical analyserer for murine eksperimentelle innstillinger. Murine eksperimentelle modeller av menneskelige sykdommer som involverer forandringer av vev arkitektur, mobilnettet vev infiltrere eller betennelse i ulike vev og organer (tarmen, hjerne, lever, hud) kan bruke den økte kvaliteten på den eksempel forberedelse til histopathological eksamen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi benytter automatisert fremgangsmåten under utarbeidelsen av murine vev for histopathologic analyse. Denne protokollen tar sikte på å gi tekniske tips for å øke reproduserbarhet og standardisering av hele prosessen, dermed forsterke den generelle kvaliteten på den endelige histopathological evalueringen. Vi implementert automatisert instrumenter og metoder for utarbeidelse og innebygging av vev, rutinemessig brukes i patologi kjernen anlegg for studiet av menneskelig prøver.
For å de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Institutt for patologi på IRCCS Policlinico Hospital, Milan kundestøtte og IEO dyr anlegget for hjelp i dyr.
Materials
| Absolute Ethanol anhydrous | Carlo Erba | 414605 | reagent |
| Absolute ETOH | Honeywell | 02860-1L | reagent |
| Aluminium Potassium Sulfate | SIGMA | A6435 | reagent |
| Aniline Blue | SIGMA | 415049 | reagent |
| carbol Fuchsin | SIGMA | C4165 | reagent |
| CD11b (clone M1/70) | TONBO biosciences | 35-0112-U100 | antibody |
| CD20 IHC (clone SA275A11) | Biolegend | 150403 | antibody |
| CD3 (17A2) | TONBO biosciences | 35-0032-U100 | antibody |
| CD4 (GK1.5) | BD Biosciences | 552051 | antibody |
| CD45.2 (clone 104) | BioLegend | 109837 | antibody |
| CD8 (53-6.7) | BD Biosciences | 553031 | antibody |
| Citrate Buffer pH 6 10X | SIGMA | C9999 | reagent |
| Dab | Vector Laboratories | SK-4100 | reagent |
| DPBS 1X | Microgem | L0615-500 | reagent |
| DSS | TdB Consultancy | DB001 | reagent |
| EDTA | SIGMA | E9884 | reagent |
| EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex Substrate | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex/HRP | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex+ Rat Linker | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| Eosin | VWR | 1.09844 | reagent |
| F4/80 (clone BM8) | BioLegend | 123108 | antibody |
| Formalin | PanReac | 2,529,311,215 | reagent |
| glacial acetic acid | SIGMA | 71251 | reagent |
| Goat-anti-Rat-HRP | Agilent DAKO | P0448 | antibody |
| Haematoxylin | DIAPATH | C0303 | reagent |
| LEICA Rotary microtome (RM2255) | Leica | RM2255 | equipment |
| Ly6g (clone 1A8) | BD Biosciences | 551459 | antibody |
| Mercury II Oxide | SIGMA | 203793 | reagent |
| Omnis Clearify Clearing Agent | DAKO | CACLEGAL | reagent |
| Omnis EnVision Flex TRS | DAKO | GV80011-2 | reagent |
| Orange G | SIGMA | O3756 | reagent |
| Paraffin | Sakura | 7052 | reagent |
| Peloris | LEICA | equipment | |
| Percoll | SIGMA | P4937 | reagent |
| RPMI 1640 without L-Glutamine | Microgem | L0501-500 | reagent |
| STS020 | Leica | equipment | |
| Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette | SAKURA | 7022 | equipment |
| Tissue-Tek Automated paraffin embedder | Sakura | equipment | |
| Xylene | J.T.Baker | 8080.1000 | reagent |
Riferimenti
- Gibson-Corley, K. N., et al. Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research. Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).
- Olivier, A. K., et al. Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory. Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).
- Gibson-Corley, K. N., Olivier, A. K., Meyerholz, D. K. Principles for valid histopathologic scoring in research. Veterinary pathology. 50, 1007-1015 (2013).
- Stolfi, C., et al. Involvement of interleukin-21 in the regulation of colitis-associated colon cancer. The Journal of experimental medicine. 208, 2279-2290 (2011).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
- Peters, S. R. . A Practical Guide to Frozen Section Technique. , (2010).
- Rosai, J. . Rosai and Ackerman’s Surgical Pathology. , (2011).
- Blumberg, R. S., Saubermann, L. J., Strober, W. Animal models of mucosal inflammation and their relation to human inflammatory bowel disease. Current opinion in immunology. 11, 648-656 (1999).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature. 2, 541-546 (2007).
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual review of immunology. 28, 573-621 (2010).
- Cribiù, F. M., Burrello, C., et al. Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis. European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).
