Uso de sistemas robóticos para procesar e integrar colónicas murinas muestras para análisis histológicos
Summary
Falta de estandarización para el procesamiento de tejido murino reduce la calidad del análisis histopatológico murino en comparación con los especímenes humanos. Aquí, presentamos un protocolo para realizar el examen histopatológico de tejidos colon inflamados y uninflamed murinos para demostrar la viabilidad de sistemas robóticos que se utilizan habitualmente para el tratamiento y la inclusión de muestras humanas.
Abstract
La comprensión de enfermedades humanas se ha ampliado considerablemente gracias al estudio de modelos animales. Sin embargo, la evaluación histopatológica de modelos experimentales debe ser tan riguroso como el que aplica para muestras humanas. De hecho, extraer conclusiones fiables y precisas críticamente está influenciada por la calidad de la preparación de la sección de tejido. Aquí, describimos un protocolo para el análisis histopatológico de los tejidos murinos que implementa varios pasos automatizados durante el procedimiento, desde la preparación inicial para la inclusión en parafina de las muestras murinas. La reducción de variables metodológicas mediante la estandarización de protocolo riguroso de procedimientos automatizados contribuye al aumento de la fiabilidad global del análisis patológico murino. Específicamente, este protocolo describe la utilización de tratamiento automatizado e incorporar sistemas robóticos, utilizado habitualmente para el proceso de tejido y la inclusión en parafina de muestras humanas, para procesar a muestras murinas de inflamación intestinal. Concluimos que la fiabilidad de la examinación histopatológica de los tejidos murinos se aumentó significativamente con la introducción de técnicas estandarizadas y automatizadas.
Introduction
En las últimas décadas, se han desarrollado varios modelos experimentales para diseccionar los mecanismos patogénicos que conducen a enfermedades humanas1,2. Para evaluar la severidad de una enfermedad, los investigadores deben evaluar el efecto de un tratamiento y estudiar las variaciones citológicas e histológicas arquitectónicas o la cantidad de inflamación3. Para realizar en los modelos experimentales, son necesarios los análisis histopatológicos detallados, a menudo comparando muestras murino y humano4,5.
Además, muestras humanas comúnmente son procesadas y anotó por las instalaciones del núcleo de histopatología y patólogos experimentados humanos a través de estandardizado métodos y criterios histopatológicos. Por el contrario, tejidos murinos son generalmente fijos, incrustados y analizados por los investigadores con experiencia limitada de protocolos histopatológicos. La calidad y fiabilidad de la examinación histopatológica comienza con la preparación de las secciones de tejido de alta calidad. Varios factores contribuyen críticamente al aumento o disminución de la calidad de definitiva, incluyendo fijación, macroscópica seccionamiento, procesamiento, de parafina inclusión, inclusión de las muestras6,7.
Todos estos pasajes que implican manipulación de la muestra están sujetos a errores manuales, incluyendo la inclusión manual de las muestras y, en menor medida, microtomo manual corte y tinción. En la actualidad, todo el proceso de preparación de tejido murino para la evaluación histológica se basa en protocolos manual y protocolos que varían de laboratorio a laboratorio. El objetivo de este estudio es implementar protocolos estandarizados automatizados para reducir errores y variabilidad en la examinación histopatológica murina.
A nuestro conocimiento, Describimos aquí los primeros protocolos de tejido completamente automatizado de procesamiento y embebido para la evaluación histológica de los tejidos murinos; Estos se utilizan habitualmente en las unidades de patología para el análisis de muestras humanas. Como un ejemplo práctico de la viabilidad del método, un modelo murino de inflamación intestinal ha sido analizado, es decir,, el modelo de colitis crónica causada por la administración repetida de sulfato de sodio de dextrano (DSS) en el agua potable8 ,9. Este ajuste experimental de cerca se asemeja a humano inflamatoria intestinal (EII) las enfermedades10 puesto que animales tratados con DSS exhiben signos de inflamación intestinal, por ejemplo, pérdida de peso, heces sueltas o diarrea y acortamiento del colon, así como fibrosis 8,9,11. Como observado en pacientes humanos con enfermedad inflamatoria intestinal, tratamiento de DSS genera un curso de la enfermedad compleja. En este contexto, elaboradas evaluaciones histológicas están obligadas a entender la profunda alteración de la arquitectura del tejido. Así, la aplicación de los protocolos descritos para aumentar la calidad de preparación de la muestra podría beneficiarse los investigadores basándose en la interpretación de histológicos y análisis immunohistochemical para la configuración experimental murino. Modelos experimentales murinos de enfermedades humanas que implican alteraciones de la arquitectura del tejido, la presencia de infiltrado de tejido celular o inflamación de diferentes tejidos y órganos (intestino, cerebro, hígado, piel) puede utilizar el aumento de la calidad de la preparación de muestras para examen histopatológico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizamos diferentes pasos automatizados durante la preparación de tejidos murinos para análisis histopatológico. Este protocolo tiene como objetivo brindar consejos técnicos para aumentar la reproducibilidad y la estandarización de todo el proceso, mejorando así la calidad de la evaluación histopatológica definitiva. Implementamos instrumentos automatizados y métodos para la preparación y fijación de los tejidos, habitualmente utilizados en las instalaciones de base de patología para el estudio de especíme…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Departamento de patología del IRCCS Policlinico Hospital, Milan para el soporte técnico y la facilidad de Animal de IEO para asistencia en la ganadería.
Materials
| Absolute Ethanol anhydrous | Carlo Erba | 414605 | reagent |
| Absolute ETOH | Honeywell | 02860-1L | reagent |
| Aluminium Potassium Sulfate | SIGMA | A6435 | reagent |
| Aniline Blue | SIGMA | 415049 | reagent |
| carbol Fuchsin | SIGMA | C4165 | reagent |
| CD11b (clone M1/70) | TONBO biosciences | 35-0112-U100 | antibody |
| CD20 IHC (clone SA275A11) | Biolegend | 150403 | antibody |
| CD3 (17A2) | TONBO biosciences | 35-0032-U100 | antibody |
| CD4 (GK1.5) | BD Biosciences | 552051 | antibody |
| CD45.2 (clone 104) | BioLegend | 109837 | antibody |
| CD8 (53-6.7) | BD Biosciences | 553031 | antibody |
| Citrate Buffer pH 6 10X | SIGMA | C9999 | reagent |
| Dab | Vector Laboratories | SK-4100 | reagent |
| DPBS 1X | Microgem | L0615-500 | reagent |
| DSS | TdB Consultancy | DB001 | reagent |
| EDTA | SIGMA | E9884 | reagent |
| EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex Substrate | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex/HRP | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex+ Rat Linker | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| Eosin | VWR | 1.09844 | reagent |
| F4/80 (clone BM8) | BioLegend | 123108 | antibody |
| Formalin | PanReac | 2,529,311,215 | reagent |
| glacial acetic acid | SIGMA | 71251 | reagent |
| Goat-anti-Rat-HRP | Agilent DAKO | P0448 | antibody |
| Haematoxylin | DIAPATH | C0303 | reagent |
| LEICA Rotary microtome (RM2255) | Leica | RM2255 | equipment |
| Ly6g (clone 1A8) | BD Biosciences | 551459 | antibody |
| Mercury II Oxide | SIGMA | 203793 | reagent |
| Omnis Clearify Clearing Agent | DAKO | CACLEGAL | reagent |
| Omnis EnVision Flex TRS | DAKO | GV80011-2 | reagent |
| Orange G | SIGMA | O3756 | reagent |
| Paraffin | Sakura | 7052 | reagent |
| Peloris | LEICA | equipment | |
| Percoll | SIGMA | P4937 | reagent |
| RPMI 1640 without L-Glutamine | Microgem | L0501-500 | reagent |
| STS020 | Leica | equipment | |
| Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette | SAKURA | 7022 | equipment |
| Tissue-Tek Automated paraffin embedder | Sakura | equipment | |
| Xylene | J.T.Baker | 8080.1000 | reagent |
Riferimenti
- Gibson-Corley, K. N., et al. Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research. Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).
- Olivier, A. K., et al. Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory. Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).
- Gibson-Corley, K. N., Olivier, A. K., Meyerholz, D. K. Principles for valid histopathologic scoring in research. Veterinary pathology. 50, 1007-1015 (2013).
- Stolfi, C., et al. Involvement of interleukin-21 in the regulation of colitis-associated colon cancer. The Journal of experimental medicine. 208, 2279-2290 (2011).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
- Peters, S. R. . A Practical Guide to Frozen Section Technique. , (2010).
- Rosai, J. . Rosai and Ackerman’s Surgical Pathology. , (2011).
- Blumberg, R. S., Saubermann, L. J., Strober, W. Animal models of mucosal inflammation and their relation to human inflammatory bowel disease. Current opinion in immunology. 11, 648-656 (1999).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature. 2, 541-546 (2007).
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual review of immunology. 28, 573-621 (2010).
- Cribiù, F. M., Burrello, C., et al. Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis. European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).
