Isolering, sekventering og analysere ekstracellulære MicroRNA fra humane mesenkymale stamceller
Summary
Denne protokol demonstrerer, hvordan til at rense ekstracellulære MicroRNA fra celle kultur medier for små RNA bibliotek opbygning og næste generation sequencing. Forskellige kvalitetskontrol checkpoints er beskrevet til at give læserne til at forstå, hvad de kan forvente når du arbejder med lav input prøver som exRNAs.
Abstract
Ekstracellulære og cirkulerende RNA’er (exRNA) er produceret af mange celletyper i kroppen og findes i talrige kropsvæsker såsom spyt, plasma, serum, mælk og urin. Et undersæt af disse RNA’er er posttranskriptionelle lovgiverne – MicroRNA (miRNAs). For at afgrænse miRNAs produceret af specifikke celletyper, in vitro-kultur systemer kan bruges til at høste og profil exRNAs stammer fra en delmængde af celler. De udskilles faktorer af mesenkymale stamceller er impliceret i lindre mange sygdomme og bruges som in vitro-modelsystemet her. Dette papir beskriver processen for indsamling, rensning af små RNA og bibliotek generation at sekvens ekstracellulære miRNAs. ExRNAs fra kultur medier afviger fra cellulære RNA ved at være lavt RNA input prøver, som opfordrer til optimeret procedurer. Denne protokol giver en omfattende guide til små exRNA sekventering fra dyrkningsmedier, viser kvalitetskontrol checkpoints på hvert trin under exRNA rensning og sekventering.
Introduction
Ekstracellulære og cirkulerende RNA’er (exRNAs) er til stede i forskellige kropsvæsker og er resistente mod RNases1,2. Deres høje overflod, stabilitet og brugervenlighed tilgængelighed er attraktive for klinisk vurdering som diagnostiske og prognostiske markører3. Transportform for exRNAs omfatter ekstracellulære vesikler (EVs), association med lipoprotein (såsom high-density lipoprotein; HDL) og ribonucleoprotein komplekser (såsom med Argonaute2 komplekser)4.
Et undersæt af exRNAs er MicroRNA (miRNAs), som er små, ikke-kodende RNA’er af omkring 22 nt, der regulerer posttranskriptionelle genekspression. Ex-miRNAs har været impliceret i celle-celle kommunikation og regulering af celle homøostase5. For eksempel, HDL leverer ex-miR-223 i endothelial celler til at undertrykke intercellulære vedhæftning molekyle 1 (ICAM-1) og betændelse6. Interessant, ses miR-223 også transporteres af ekstracellulære vesikler fra leukocytter til lunge kræftceller, programmering dem til at påtage sig en mere invasive fænotype7. Således vil transkriptom af ex-miRNAs fra forskellige kropsvæsker og cellekulturmedium forbedre vores forståelse af ex-miRNA signalering.
Små RNA sekventering (små RNA FF.) er et kraftfuldt værktøj, der kan bruges til at forstå transcriptomics af små RNA’er. Ikke kun kan sammenlignes med forskellige stikprøver blandt varierende udtrykt kendte RNA’er, men romanen små RNA’er kan også registreres og karakteriseret. Derfor er det også en robust metode til at identificere varierende udtrykt miRNAs under forskellige betingelser. En af forhindringerne for små RNA seq er imidlertid vanskeligheder med at skabe små RNA seq biblioteker fra lav exRNA input væsker som cerebrospinal væsker, spyt, urin, mælk, serum og kultur medier. TruSeq små RNA bibliotek Prep protokollen fra Illumina kræver ca 1 µg af høj kvalitet total RNA og NEBNext små RNA bibliotek Prep indstille protokollen fra New England Biolabs kræver 100 ng-1 µg RNA8,9. Oftentimes, total RNA fra disse prøver er under detektionsgrænsen for konventionelle UV-vis spektrofotometre.
Ex-miRNAs afledt af kropsvæsker er potentielt god diagnostiske og prognostiske markører. Men for at studere de funktionelle virkninger eller for at bestemme oprindelsen af specifikke ex-miRNAs celle kultur systemer ofte bruges i stedet. Mesenchymale stamceller (msc) har været studeret grundigt, fordi deres evt har været impliceret i lindre mange sygdomme, herunder myokardieinfarkt, Alzheimers sygdom og graft versus host sygdommen10. Her, vise vi rensning af ex-miRNAs fra knoglemarv-afledte MSCs (BMSCs) og de specifikke trin bruges til at optimere små RNA bibliotek byggeri, sekventering og dataanalyse (figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Her, beskriver vi en protokol for næste generation sequencing af exRNAs, der muliggør differentieret udtryk analyser fra lav input prøver. Tilslutte sig en bestemt protokol for EV og exRNA isolation er vigtig, fordi selv små ændringer (dvs. ultracentrifugering trin eller en ændring i rotoren type) kan påvirke transkriptom og miRNA niveauer13,14. Derfor, uanset hvordan exRNA er isoleret, er det vigtigt at anvende samme eksperimentelle og bioinformatic proce…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for Mr. Claus Bus og Ms. Rita Rosendahl ved iNANO for deres tekniske bistand. En særlig tak til Dr. Daniel Otzen for at tillade vores hyppige brug af hans ultracentrifuge. Denne undersøgelse blev støttet af Danmarks innovationsfond (MUSTER projekt).
Materials
| Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells | ATCC | PCS-500-012 | Cells used in this protocol was bought from ATCC |
| MSCGM BulletKit | Lonza | PT-3001 | Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media) |
| Exosome-depleted FBS | Gibco | A2720801 | |
| ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS | |||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| T175 Flask | Sarstedt | 833,912 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 806552 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter | 355618 | |
| Beckman Coulter Type 60 Ti | Rotor used here | ||
| NucleoCounter | Chemometec | NC-3000 | Cell Counter |
| β-glycerophosphate | Calbiochem | 35675 | Components of the osteogenic differentiation media |
| Dexamethasone | Sigma | D4902-25MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | Components of the osteogenic differentiation media |
| 1α,25-Dihydroxyvitamin D3 | Sigma | D1530-1MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | miRNA and total RNA purification kit for step 4.8 |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1514 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche | KK4824 | Library quantification kit used here |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | Small RNA library prepartion kit used in this protocol – used in step 5 |
| Pippin Prep | Sage Science | Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | PCR purification in step 5.17 |
| FASTX_Toolkit | Cold Spring Harbor Lab | Trimming low-quality reads in step 6 | |
| cutadapt | Adaptor removal in step 6 | ||
| Bowtie | Mapping of clean reads in step 6 | ||
| Samtools | To make the expression profile in step 6 | ||
| Bedtools | To make the expression profile in step 6 |
Riferimenti
- Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. The complexity, function and applications of RNA in circulation. Frontiers in Genetics. 4, 115 (2013).
- Koberle, V., et al. Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers. Plos One. 8 (9), e75184 (2013).
- Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. A. Clinical utility of circulating non-coding RNAs – an update. Nature Reviews Clinical Oncology. , (2018).
- Li, K., et al. Advances, challenges, and opportunities in extracellular RNA biology: insights from the NIH exRNA Strategic Workshop. JCI Insight. 3 (7), (2018).
- Turchinovich, A., Samatov, T. R., Tonevitsky, A. G., Burwinkel, B. Circulating miRNAs: cell-cell communication function. Frontiers in Genetics. 4, 119 (2013).
- Tabet, F., et al. HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells. Nature Communications. 5, 3292 (2014).
- Zangari, J., et al. Rapid decay of engulfed extracellular miRNA by XRN1 exonuclease promotes transient epithelial-mesenchymal transition. Nucleic Acids Research. 45 (7), 4131-4141 (2017).
- . TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support Input Requirements Available from: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html (2018)
- . NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina Set 1, Set 2, Index Primers 1–48 and Multiplex Compatible Instruction Manual Available from: https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf (2018)
- Heldring, N., Mager, I., Wood, M. J. A., Le Blanc, K., Andaloussi, S. E. L. Therapeutic Potential of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and Their Extracellular Vesicles. Human Gene Therapy. 26 (8), 506-517 (2015).
- Ullah, I., Subbarao, R. B., Rho, G. J. Human mesenchymal stem cells – current trends and future prospective. Bioscience Reports. 35 (2), (2015).
- Szatanek, R., et al. The Methods of Choice for Extracellular Vesicles (EVs) Characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), (2017).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).
- Van Deun, J., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
- Raabe, C. A., Tang, T. H., Brosius, J., Rozhdestvensky, T. S. Biases in small RNA deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (3), 1414-1426 (2014).
- Reza, A. M., Choi, Y. J., Yasuda, H., Kim, J. H. Human adipose mesenchymal stem cell-derived exosomal-miRNAs are critical factors for inducing anti-proliferation signalling to A2780 and SKOV-3 ovarian cancer cells. Scientific Reports. 6, 38498 (2016).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Asghar, M. T., et al. Sphingomonas sp is a Novel Cell Culture Contaminant. Journal of Cellular Biochemistry. 116 (6), 934-942 (2015).
