Изоляция, виртуализации и анализа внеклеточного микроРНК от мезенхимальных стволовых клеток человека
Summary
Этот протокол показано, как очистить внеклеточного микроРНК носителя культуры клеток для малых РНК библиотеки строительных и следующего поколения последовательности. Чтобы позволить читателям понять, чего ожидать при работе с низкой ввода образцы как exRNAs описаны различные контрольно-пропускные пункты контроля качества.
Abstract
Внеклеточные и циркулирующего РНК (exRNA) производятся многие типы клеток организма и существуют в многочисленных телесных жидкостей, таких как слюна, плазмы, сыворотки, молоко и мочи. Одно подмножество этих молекул РНК являются посттранскрипционного регуляторы – микроРНК (интерферирующим). Разграничить адаптивной, производимых типов конкретных клеток, в пробирке культуры системы могут использоваться для сбора и профиль exRNAs, полученных от одного подмножество ячеек. Выделяется факторы мезенхимальных стволовых клеток вовлечены в облегчении многочисленных заболеваний и используется как в пробирке модель системы здесь. Этот документ описывает процесс сбора, очистки малых РНК и библиотека поколения внеклеточного интерферирующим последовательности. ExRNAs от культуры средств массовой информации отличаются от клеточной РНК, будучи низкий входной образцов РНК, которая вызывает для оптимизации процедур. Этот протокол обеспечивает полное руководство для малых exRNA последовательности носителя культуры, показаны контрольно-пропускные пункты контроля качества на каждом этапе во время exRNA очистки и последовательности.
Introduction
Внеклеточные и циркулирующих РНК (exRNAs) в различных жидкостях и устойчивы к полиадениновый1,2. Их многочисленность, стабильность и легкость доступа являются привлекательными для клинической оценки как диагностические и прогностические маркеры3. Режим транспорта для exRNAs включают внеклеточного везикулы (EVs), ассоциации с липопротеинов (например липопротеидов высокой плотности; HDL) и рибонуклеопротеида комплексы (такие как с Argonaute2 комплексами)4.
Подмножество exRNAs являются микроРНК (интерферирующим), которые являются небольшие некодирующих РНК из около 22 nt, которые регулируют экспрессию генов посттранскрипционного. Экс адаптивной были причастны к ячейке коммуникации и регуляции гомеостаза клетки5. К примеру, HDL поставляет экс мир-223 эндотелиальных клеток для подавления Межмицеллярная молекула 1 (ICAM-1) и воспаление6. Интересно, что мир-223 рассматривается также перевозимых на внеклеточные везикулы легких раковых клеток, программирование их брать на более инвазивных фенотип7из лейкоцитов. Таким образом транскриптом экс адаптивной различных телесные жидкости и клетки культуры среднего значительно улучшит наше понимание экс miRNA сигнализации.
Некодирующие РНК последовательности (seq малых РНК) является мощным инструментом, который может использоваться для понимания transcriptomics малых РНК. Не только можно сравнить различные образцы среди дифференциально выразил известный РНК, но Роман малых РНК также могут быть обнаружены и характерны. Следовательно это также надежный метод идентификации дифференциально выраженной интерферирующим при различных условиях. Однако одна из трудностей малых РНК seq является трудность в создании малых РНК seq библиотек из низких exRNA ввода жидкостей, таких как спинномозговой жидкости, слюна, моча, молока, сыворотки и культуры средств массовой информации. TruSeq малые РНК библиотека Prep протокол от Illumina требует примерно 1 мкг высокого качества всего РНК и протокол NEBNext малых РНК библиотека Prep набор из Новой Англии Biolabs требует 100 нг-1 мкг РНК8,9. Зачастую всего РНК из этих образцов находятся ниже предела обнаружения для обычных-УФ Вид спектрофотометры.
Экс адаптивной производным от жидкостями являются потенциально хорошие диагностических и прогностических маркеров. Однако чтобы изучить функциональные последствия или определить происхождение конкретных экс адаптивной, клетки культуры системы часто используются вместо этого. Мезенхимальных стволовых клеток (МСК) были изучены широко потому, что их EVs были вовлечены в облегчении многих заболеваний, включая инфаркт миокарда, болезни Альцгеймера и трансплантат против принимающей болезни10. Здесь мы демонстрируем очистки экс адаптивной из костного мозга, полученных MSCs (BMSCs) и конкретные шаги, используемые для оптимизации малых РНК библиотека строительства, последовательности и анализ данных (рис. 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем протокол для следующего поколения последовательности exRNAs, который позволяет анализ дифференциального выражение от низкого входного образцов. Придерживаясь определенных протоколов для изоляции EV и exRNA важно, потому что даже небольшие изменения (например, шаг ultracentrif…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны г-н Клаус автобус и г-жа Рита Rosendahl на iNANO за их технической помощи. Особая благодарность д-р Даниэль Otzen позволяя нашим частым использованием его ультрацентрифугирования. Это исследование было поддержано в инновационный фонд Дании (MUSTER проекта).
Materials
| Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells | ATCC | PCS-500-012 | Cells used in this protocol was bought from ATCC |
| MSCGM BulletKit | Lonza | PT-3001 | Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media) |
| Exosome-depleted FBS | Gibco | A2720801 | |
| ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS | |||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| T175 Flask | Sarstedt | 833,912 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 806552 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter | 355618 | |
| Beckman Coulter Type 60 Ti | Rotor used here | ||
| NucleoCounter | Chemometec | NC-3000 | Cell Counter |
| β-glycerophosphate | Calbiochem | 35675 | Components of the osteogenic differentiation media |
| Dexamethasone | Sigma | D4902-25MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | Components of the osteogenic differentiation media |
| 1α,25-Dihydroxyvitamin D3 | Sigma | D1530-1MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | miRNA and total RNA purification kit for step 4.8 |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1514 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche | KK4824 | Library quantification kit used here |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | Small RNA library prepartion kit used in this protocol – used in step 5 |
| Pippin Prep | Sage Science | Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | PCR purification in step 5.17 |
| FASTX_Toolkit | Cold Spring Harbor Lab | Trimming low-quality reads in step 6 | |
| cutadapt | Adaptor removal in step 6 | ||
| Bowtie | Mapping of clean reads in step 6 | ||
| Samtools | To make the expression profile in step 6 | ||
| Bedtools | To make the expression profile in step 6 |
Riferimenti
- Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. The complexity, function and applications of RNA in circulation. Frontiers in Genetics. 4, 115 (2013).
- Koberle, V., et al. Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers. Plos One. 8 (9), e75184 (2013).
- Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. A. Clinical utility of circulating non-coding RNAs – an update. Nature Reviews Clinical Oncology. , (2018).
- Li, K., et al. Advances, challenges, and opportunities in extracellular RNA biology: insights from the NIH exRNA Strategic Workshop. JCI Insight. 3 (7), (2018).
- Turchinovich, A., Samatov, T. R., Tonevitsky, A. G., Burwinkel, B. Circulating miRNAs: cell-cell communication function. Frontiers in Genetics. 4, 119 (2013).
- Tabet, F., et al. HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells. Nature Communications. 5, 3292 (2014).
- Zangari, J., et al. Rapid decay of engulfed extracellular miRNA by XRN1 exonuclease promotes transient epithelial-mesenchymal transition. Nucleic Acids Research. 45 (7), 4131-4141 (2017).
- . TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support Input Requirements Available from: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html (2018)
- . NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina Set 1, Set 2, Index Primers 1–48 and Multiplex Compatible Instruction Manual Available from: https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf (2018)
- Heldring, N., Mager, I., Wood, M. J. A., Le Blanc, K., Andaloussi, S. E. L. Therapeutic Potential of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and Their Extracellular Vesicles. Human Gene Therapy. 26 (8), 506-517 (2015).
- Ullah, I., Subbarao, R. B., Rho, G. J. Human mesenchymal stem cells – current trends and future prospective. Bioscience Reports. 35 (2), (2015).
- Szatanek, R., et al. The Methods of Choice for Extracellular Vesicles (EVs) Characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), (2017).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).
- Van Deun, J., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
- Raabe, C. A., Tang, T. H., Brosius, J., Rozhdestvensky, T. S. Biases in small RNA deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (3), 1414-1426 (2014).
- Reza, A. M., Choi, Y. J., Yasuda, H., Kim, J. H. Human adipose mesenchymal stem cell-derived exosomal-miRNAs are critical factors for inducing anti-proliferation signalling to A2780 and SKOV-3 ovarian cancer cells. Scientific Reports. 6, 38498 (2016).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Asghar, M. T., et al. Sphingomonas sp is a Novel Cell Culture Contaminant. Journal of Cellular Biochemistry. 116 (6), 934-942 (2015).
