Polmone microRNA Profiling attraverso il ciclo estrale in topi esposti a ozono

Summary

Qui descriviamo un metodo per valutare l'espressione di polmone di Mirna che sono preveduti per regolare i geni infiammatori utilizzando topi esposti all'ozono o aria filtrata nelle diverse fasi del ciclo estrale.

Abstract

Profilatura di MicroRNA (miRNA) è diventato di interesse per i ricercatori che lavorano in diverse aree di ricerca della biologia e della medicina. Gli studi correnti indicano un promettente futuro di utilizzando miRNA nella diagnosi e cura di malattie polmonari. Qui, viene definito un protocollo per i miRNA profilatura per misurare l'abbondanza relativa di un gruppo di Mirna preveduti che regolano i geni infiammatori nel tessuto polmonare da di un modello di topo di infiammazione delle vie aeree indotta da ozono. Perché è stato dimostrato che livelli di ormoni sessuali circolanti possono influire sulla regolazione dell'immunità innata del polmone nelle femmine, lo scopo di questo metodo è di descrivere un miRNA infiammatoria profilatura protocollo nei topi femmina, prendendo in considerazione il ciclo estrale fase di ogni animale al momento dell'esposizione all'ozono. Ci rivolgiamo anche approcci di bioinformatica applicabile a miRNA discovery e destinazione metodi di identificazione tramite limma, un software R/Bioconductor, e software di analisi funzionale per capire il contesto biologico e percorsi associati con espressione differenziale dei miRNA.

Introduction

i microRNA (Mirna) sono brevi (19-25 nucleotidi), naturale, non-codificanti molecole di RNA. Sequenze di Mirna sono evolutivi conservata tra le specie, suggerendo l'importanza di miRNA nel regolare le funzioni fisiologiche¹. Profilo di espressione di microRNA ha dimostrato di essere utile per l'identificazione di Mirna che sono importanti nella regolazione di vari processi, tra cui la risposta immunitaria, differenziamento cellulare, processi di sviluppo e apoptosi². Più recentemente, Mirna sono stati riconosciuti per il loro uso potenziale nella malattia diagnostica e terapeutica. Per i ricercatori che studiano i meccan....

Protocol

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della Penn State University.

1. valutazione della fase del ciclo estrale

1. Frenare correttamente una femmina mouse C57BL/6 (8 – 9 settimane) utilizzando la tecnica di ritenuta del mouse con una sola mano descritta in Machholz et al.¹⁰.
2. Riempire la pipetta di plastica sterile con 10 μL di acqua ultra-pura.
3. Introdurre la punta della pipetta di plastica nella vagina.
4. Sciacquare delicatamente il liquido 4 – 5 volte per raccogliere il campione.
5. Posizionare il filo finale c....

Results

I tipi differenti delle cellule osservati negli strisci vengono utilizzati per identificare la fase del ciclo estrale del mouse (Figura 1). Questi sono identificati dalla morfologia delle cellule. Durante il proestro, le cellule sono quasi esclusivamente gruppi di cellule epiteliali nucleate forma circolare, ben formate (Figura 1A). Quando il mouse è in fase di estro, le cellule sono cellule epiteliali squamous cornified, present.......

Discussion

MicroRNA profiling è una tecnica vantaggiosa sia per la diagnosi delle malattie e ricerca meccanicistico. In questo manoscritto, abbiamo definito un protocollo per la valutazione dell'espressione dei miRNA che sono preveduti per regolare i geni infiammatori nei polmoni dei topi femminili esposti all'ozono nelle fasi differenti ciclo estrale. Metodi per la determinazione del ciclo estrale, ad esempio il metodo di rilevamento visivo, sono stati descritti¹⁶. Tuttavia, questi si basano su misure una t.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Topi C57BL/6J	The Jackson Laboratory	000664	8 settimane
Acqua ultrapura	Thermo Fisher Scientific	10813012
Pipetta in plastica sterile	Fisher Scientific	13-711-25	Capacità: 1,7 mL
Vetrini per microscopio smerigliato	Thermo Fisher Scientific	2951TS
Microscopio ottico	Microscope World	MW3-H5	10x e 20x obiettivo
Ketathesia- Ketamina HCl Iniezione USP	Henry Schein Animal Health	55853	90 mg/kg. Farmaco controllato.
Xilazina Soluzione Sterile	Lloyd Laboratories	139-236	10 mg/kg. Farmaco controllato.
Etanolo	Fisher Scientific	BP2818100	Diluire al 70% di etanolo con acqua.
Ago calibro 21 G	BD Biosciences	305165
Siringa	Fisher Scientific	329654	1 mL
Forbici operative	World Precision Instruments	501221, 504613	14 cm, affilato/smussato, curvo e 9 cm, dritto, fine
pinzetta	Precision Instruments	504616
Spectrum  Frantumatori tissutali Bessman	Fisher Scientific	08-418-1	Capacità: da 10 a 50 mg
Provette per microfughe prive di RNasi	Thermo Fisher Scientific AM12400		1,5 mL
Reagente TRIzol	Thermo Fisher Scientific	15596026
RNA Direct-zol MiniPrep Plus	Zymo Research	R2071
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W
Kit miScript II RT	Qiagen	218161
Risposta infiammatoria del topo & Autoimmunità miRNA PCR Array	Qiagen	MIMM-105Z
Provette PCR a parete sottile, prive di DNasi, senza RNasi	Thermo Fisher Scientific	AM12225	per 20 μ Reazioni L
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control	Qiagen	219610
Microsoft Excel	Microsoft Corporation		https://office.microsoft.com/excel/
Ingenuity Pathway Analysis	Qiagen		https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/
R Software	The R Foundation		https://www.r-project.org/
Termociclatore o blocco di raffreddamento/riscaldamento	Fornitore generale da laboratorio Microcentrifuga
	Fornitore generale da laboratorio Cycler
in tempo reale Fornitore	generale da laboratorio Pipettatore
multicanale	Fornitore generale da laboratorio Tampone
di lavaggio RNA	Zymo Research	R1003-3-48	48 mL
tampone di digestione DNA	Zymo Research	E1010-1-4	mL
RNA tampone di prelavaggio	Zymo Research	R1020-2-25	25 mL
Analizzatore di ozono ultravioletto	Teledyne API	Modello T400	http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400
Regolatori di flusso di massa	Sierra Instruments Inc	Flobox 951/954	http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html