Qui, descriviamo un protocollo dettagliato che delinea una fluorescente nuova tecnica per la rilevazione di proteine totali in gel di poliacrilammide di pittura. Il protocollo utilizza una sonda d'argento dello ione specifico fluorescenza accensione, rileva Ag+-complessi della proteina ed Elimina alcune limitazioni dei tradizionali cromogeniche macchie d'argento.
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Articolo metodologico
Fluorescente macchiatura d'argento delle proteine nel gel di poliacrilammide
In questo articolo
Sommario
Abstract
Macchiatura d'argento è una tecnica colorimetrica ampiamente utilizzata per visualizzare le bande proteiche in gel di poliacrilammide dopo elettroforesi del gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE). Le macchie d'argento classiche hanno alcuni inconvenienti, come alta priorità bassa che macchia, recupero di proteina povera, scarsa riproducibilità, una gamma dinamica lineare stretta per la quantificazione e la limitata compatibilità con spettrometria di massa (MS). Ora, con l'uso di una sonda di fluorogenic Ag+ , TPE-4TA, abbiamo sviluppato un fluorescente argento che macchia il metodo per la visualizzazione di proteine totali in gel di poliacrilammide. Questa nuova macchia evita il passaggio di riduzione d'argento fastidioso in tradizionali macchie d'argento. Inoltre, la macchia d'argento fluorescente dimostra buona riproducibilità, sensibilità e quantificazione lineare nella rilevazione della proteina, rendendolo una macchia di gel di proteina utile e pratico.
Introduzione
Molti metodi di colorazione sono state usate per visualizzare proteine elettroforesi su gel in seguito, ad esempio utilizzando coloranti colorimetrici come Coomassie Brilliant Blue, macchia d'argento, fluorescenza, o radioattivo etichettatura1,2, 3 , 4. macchiatura d'argento è considerata una delle tecniche più sensibili per la rilevazione di proteine che richiedono reagenti semplici ed economici. Possono essere classificato in due famiglie principali: la macchia d'argento ammoniacale e il nitrato d'argento macchia5
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Protocollo
1. preparazione del Gel
Nota: La dimostrazione segue un protocollo standard per preparare il gel per la colorazione poco dopo SDS-PAGE12. In breve, i passaggi seguenti descrivono la preparazione dei campioni e l'elettroforesi del gel.
- Eseguire SDS-PAGE con gel di proteina 4% - 12% Bis-Tris (1 mm, 15-bene) usando un carro armato del gel mini riempiti di 2-(N -morfolino) buffer di ethanesulfonic acido (MES).
- Diluire i campioni con una miscela di acqua distillata, litio dodecil solfato (LDS) buffer e un agente di riduzione del campione.
- Caricare la prima corsia con il doppio della ....
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Risultati
Le bande proteiche macchiate dalla macchia d'argento fluorescente presentano una fluorescenza verde intensa sotto una lampada a UV 365 nm. Tutte le bande di proteina 14 (10-200 kDa), da cima a fondo, erano chiaramente visibili, che correlano bene con 14 quelli colore rosso macchiati dalla SYPRO Ruby tintura (Figura 2)10.
Per quanto riguarda la rilevazione quantitativa della p.......
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Discussione
Presentato qui è un romanzo fluorescente argento che macchia il metodo per le proteine nel gel di poliacrilammide. Questa strategia integra le macchie d'argento convenzionale e la colorazione fluorescente. Le gesta di colorazione il legame selettivo di ioni d'argento per proteine come in altri argento macchie ma impiega un argento altamente sensibile fluorogenic sonda TPE-4TA per illuminare le proteine rilegate d'argento. Poiché la sonda fluorogenic TPE-4TA può percepire gli ioni d'argen.......
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Dichiarazioni
È stata presentata una domanda di brevetto su questo fluorescente macchiatura d'argento.
Ringraziamenti
Gli autori vorrei ringraziare Patrick Chan presso il centro di Lau Wai Ming per Medicina riparativa, Karolinska Institutet, per il suo supporto tecnico. S. X. è grato per il sostegno del Consiglio di ricerca svedese (Grant No. 2017-06344).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
LDS Sample Buffer (4X) | Thermo Fisher Scientific | NP0007 | Reagente |
4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1,0 mm, 15 pozzetti | Thermo Fisher Scientific | NP0323BOX | campione in gel prefabbricato |
| (10X) | Thermo Fisher Scientific | NP0004 | Reagente |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher Scientific | NP0002 | Reagente |
| Mini Gel Tank | Thermo Fisher Scientific | A25977 | Attrezzatura |
| Alimentatore 300W (230 VAC) | Thermo Fisher Scientific | PS0301 | |
| Attrezzatura Scala di proteine non colorate | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Campione |
| Nitrato d'argento | Sigma-Aldrich | 31630-25G-R | Reagente |
| Etanolo | Bragg e co. | 42520J | Reagente |
| Acido acetico | J.T. Baker | 103201A | Reagente |
| Sintesi Milli-Q A10 | Merk-Fornisce | 18,2 MΩ. sistema di documentazione su gel d'acqua cm | |
| (modello c600) | Azure biosystems-Equipment |
Riferimenti
- Chevalier, F. Highlights on the capacities of "Gel-based" proteomics. Proteome Science. 8 (1), (2010).
- Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 6 (4), 1418-1425 (2007).
- Gauci, V. J., Wright, E. P., Coor....
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Ristampe e permessi
