蛍光タンパク質のポリアクリルアミドゲルの銀製の汚損
Summary
ここでは、新しい蛍光染色ポリアクリルアミドゲルの総蛋白質の検出の技術をまとめた詳細なプロトコルについて述べる。プロトコルを利用して Ag+を検出する銀イオン固有蛍光ターンオン プローブ-タンパク質複合体、伝統的な発色銀汚れの特定の制限を排除します。
Abstract
銀染色は、ポリアクリルアミドゲル ナトリウム dodecyl 硫酸塩-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) を次の蛋白質バンドの視覚化に広く用いられる比色法です。古典的な銀汚れ汚損、不良タンパク質の回収、低再現性、定量化、および質量分析法 (MS) と限られた互換性のダイナミック レンジの狭い線形高の背景など、いくつかの欠点があります。今、 TPE 4TA、Ag+蛍光発生プローブの使用と、蛍光銀染色ポリアクリルアミドゲルで総たんぱく可視化法を開発しました。この新しい汚れは、伝統的な銀汚れで面倒な銀削減ステップを回避できます。また、蛍光銀染色は良い再現性、感度、およびタンパク質検出後、有用かつ実用的な蛋白質ゲル染色で線形の数量を示します。
Introduction
多くの染色法がされている蛋白質ゲルの電気泳動、たとえば Coomassie 鮮やかな青、銀染色、蛍光など色の染料を使用して視覚化するために使用または放射性1,2,を表示3,4. 簡易かつ安価な試薬を必要とする蛋白質の検出のための最も敏感なテクニックの一つである銀製の汚損します。2 つの主要な家族に分類できます: 銀製硝酸塩、アンモニア銀染色染色5,6。アルカリのアンモニア銀法で銀ジアミン複合体はアンモニア、水酸化ナトリウムの生産、酸性ホルムアルデヒド溶液を用いた開発中に金属銀に減少します。汚れは、基本的な蛋白質に効率的に対応できる酸性および中性蛋白質のためパフォーマンスの低下を示していますは、さらに、古典的なグリシンやタウリン電気泳動システムに限定。比較では、硝酸銀の汚れは蛋白質に銀イオンの高い生体親和性を悪用する、主なスルフヒとカルボキシル基側鎖からグループ化しより効率的に酸性タンパク質を染色する傾向がある7。ブラウン-ダーク色を視覚化するを構築金属の銀粒子に銀イオンを抑える銀イオン結合後、現像液 (通常金属炭酸塩溶液におけるホルムアルデヒドおよびナトリウム チオ硫酸製) が適用される、タンパク質のバンド。
銀染色は 1970 年代8の開発以来その汎用性と高感度の知られているがメソッド頻繁にトリッキーないわ。銀染色方法はステップの時間制限があるし、低再現性を示します。銀染色の色は、通常ない均一でコントロールするは難しいが、削減の手順に依存しているので銀染色定量的方法ではありません、したがって、ゲルの比較研究とタンパク質定量9には推奨されません。感度の最適化方法は、アルデヒド10を染色より均一をまた提供することができますを利用できます。ただし、アルデヒドによるタンパク質の架橋によりさらに下流解析を犠牲になります。高速プロトコルは主を組み合わせるか、再現性と染色5の均一性を損なうこと、時間を短縮するには手順を短きます。その結果、多数の銀染色染色、特定の要件に合わせて最適化された各蛋白質ゲル内の亜種があります。たとえば、シンプルさ、感度、またはペプチドの回収率下流の分析。これらの属性は、互いに影響をあります、1 つのプロトコルのすべての要件を満たすは難しいことができます。
この作品は、新しい蛍光銀染色法電気泳動法でタンパク質検出用を紹介します。この方法で銀含浸タンパク質11を視覚化すると銀イオン、 TPE 4TA (図 1)、蛍光プローブを使用します。TPE 4TA凝集誘起発光 (AIE) 原則として設計されています。水溶液に溶解したとき、非発光ですが銀イオンの存在下で高発光性です。開発ステップ蛍光発色における伝統的な銀汚れに置き換える、蛍光銀法により総蛋白減少の背景を持つ堅牢な染色します。
さらに、蛍光の銀製の汚れはタンパク質の定量化は, 広く使用される可視ルビー汚れに匹敵する、伝統的な銀汚れで達成可能でない良い動的線形範囲を示した。紫外線ランプで一般的に使用されるゲルのドキュメント システムで視覚化されるゲル (励起波長: 302/365 nm チャンネル; 排出量: ~ 490-530 nm) 多くの生物のラボで。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで紹介は新規蛍光銀製の汚損ポリアクリルアミドゲルの蛋白質のためのメソッド。この戦略は、従来の銀汚れと蛍光汚れを統合します。染色攻撃他の銀のように蛋白質に銀イオンの選択的バインド汚れが高感度蛍光シルバーを採用してプローブTPE 4TA銀のバインドされた蛋白質を点灯します。それにより従来の必要に応じて還元的視覚化のステップの任意のさらなる需要がな?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、彼のサポートのため、修復医学教育研究、カロリンスカ研究所明カーウァイ ・ ラウ センターでパトリック ・ チャンを感謝したいです。S. x. はスウェーデン研究評議会 (グラント号 2017年-06344) からのサポートに感謝します。
Materials
LDS Sample Buffer (4X) |
Thermo Fisher Scientific | NP0007 | Reagent |
4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well |
Thermo Fisher Scientific | NP0323BOX | Precast gel |
| Sample Reducing Agent (10X) | Thermo Fisher Scientific | NP0004 | Reagent |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher Scientific | NP0002 | Reagent |
| Mini Gel Tank | Thermo Fisher Scientific | A25977 | Equipment |
| 300W Power Supply (230 VAC) | Thermo Fisher Scientific | PS0301 | Equipment |
| Unstained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Sample |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 31630-25G-R | Reagent |
| Ethanol | Bragg and co. | 42520J | Reagent |
| Acetic acid | J.T. Baker | 103201A | Reagent |
| Milli-Q Synthesis A10 | Merk | – | Provides 18.2 MΩ.cm water |
| gel documentation system (c600 model) | Azure biosystems | – | Equipment |
Riferimenti
- Chevalier, F. Highlights on the capacities of "Gel-based" proteomics. Proteome Science. 8 (1), (2010).
- Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 6 (4), 1418-1425 (2007).
- Gauci, V. J., Wright, E. P., Coorssen, J. R. Quantitative proteomics: assessing the spectrum of in-gel protein detection methods. Journal of Chemical Biology. 4 (1), 3-29 (2011).
- Candiano, G., Bruschi, M., et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).
- Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).
- Jin, L. T., Hwang, S. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. Sensitive silver staining of protein in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using an azo dye, calconcarboxylic acid, as a silver-ion sensitizer. Electrophoresis. 25 (15), 2494-2500 (2004).
- Celis, J. E., et al. . Cell Biology: A Laboratory Handbook. , (2006).
- Bartsch, H., Arndt, C., Koristka, S., Cartellieri, M., Bachmann, M. Silver Staining Techniques of Polyacrylamide Gels. Methods in Molecular Biology. 869 (1), 481-486 (2012).
- Rabilloud, T., Vuillard, L., Gilly, C., Lawrence, J. Silver-staining of proteins in polyacrylamide gels: a general overview. Cellular and Molecular Biology. 40 (1), 57-75 (1994).
- Zhou, M., Yu, L. Proteomic Analysis by Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Advances in Protein Chemistry. 65 (1), 57-84 (2003).
- Xie, S., et al. Fluorogenic Ag+-Tetrazolate Aggregation Enables Efficient Fluorescent Biological Silver Staining. Angewandte Chemie International Edition. 57 (20), 5750-5753 (2018).
- . Protein gel electrophoresis technical handbook Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015)
