利用高含量成像对增强细胞中的目标参与进行量化
Summary
药物靶向接触的测量是有效药物开发和化学探针验证的核心。在这里, 我们详细介绍了一种在细胞热转移分析 (cetsa) 的微板兼容适应中使用高含量成像测量药物靶点接触的协议。
Abstract
量化小分子与其预期蛋白质靶标的相互作用对于药物开发、目标验证和化学探针验证至关重要。在不改变蛋白质靶点或小分子的情况下测量这种现象的方法特别有价值, 尽管在技术上具有挑战性。细胞热转移分析 (cetsa) 是监测活细胞中目标参与的一种技术。在这里, 我们描述了对原始 cetsa 协议的改编, 该协议允许进行高吞吐量测量, 同时在单个单元级别保持亚细胞定位。我们相信该协议为 cetsa 在复杂目标相互作用的深入表征方面的应用提供了重要的进展, 特别是在细胞的异质种群中。
Introduction
在开发新药或化学探针时, 必须将观察到的药理作用或功能读数与目标占位率或参与活细胞 1,2,3的测量结合起来。这些数据是必要的, 既可以确保小分子实际上达到其预期目标, 也可以验证蛋白质靶标选择4,5背后的生物学假设。此外, 在药物开发过程中, 在临床试验之前, 使用日益复杂的模型系统来选择和证实铅化合物。为了确认生物学在这些临床前系统中的翻译, 在整个开发过程中追踪药物靶手和伴随的生物学的方法至关重要。
药物靶向参与传统上是一个具有挑战性的小分子和蛋白质的活细胞监测的难题, 特别是在具有空间分辨率6,7的单细胞水平.最近观察未修饰药物与活细胞中蛋白质相互作用的方法之一是细胞热转移试验 (cetsa), 在该方法中, 配体诱导的本地蛋白质在应对热挑战时的稳定性被量化8, 9,10。这是通过量化剩余的可溶性蛋白质后暴露在热挑战。在 ctsa 的首次公开中, 使用了西方印迹进行检测。为了能够进行筛选活动和对较大的化合物集合进行分类, 为提高 cetsa 实验的吞吐量所做的努力导致了几个均匀的、基于微板的检测10、11的开发。然而, 这些方法的一个局限性是, 它们目前最适合在细胞悬浮液中进行复合治疗, 检测需要细胞裂解, 导致空间信息丢失。ctsa 可以在实验中应用, 既可以作为在单个分子浓度下的热聚集温度 (tagg) 的配体诱导转移, 也可以应用于在单一温度下稳定蛋白质所需的配体浓度。后者被称为等温剂量响应指纹 (itdrf), 以表示这些测量的依赖性于特定的实验条件。
该方案的目的是利用 cetsa 在粘附细胞中的靶点接触进行免疫荧光 (if) 抗体检测,并进行高含量显微镜12。此过程扩展了原始的 cetsa 平台, 允许对目标参与进行单细胞量化, 并对亚细胞定位进行保护。值得注意的是, 与以往许多报告不同的是, 在这一过程中, 复合治疗是在活体粘附细胞中进行的, 在热挑战之前没有表面分离或清洗, 从而保持了我们旨在测量13的既定结合平衡。目前, 该方法已被验证为一个目标蛋白 p38α (mapk14) 在几个细胞系, 我们希望通过分享这个程序的技术可以广泛地应用于整个融化蛋白质组。我们预计, 该协议可以在整个药物开发过程中进行调整, 从筛选、打击试验到监测体内的目标参与。
Protocol
Representative Results
Discussion
如结果部分所述, 该过程有几个关键步骤。首先, 确定高质量的亲和力试剂是很重要的。我们建议为每个所需的目标筛选一个小型抗体库。在选择了初级抗体后, 如果合适的情况下, 验证蛋白质靶点的一些不同结合位点的系统也很重要。非常鼓励通过省略热挑战来反筛选干扰检测信号的化合物, 如图2所示。当观察到配体存在的减少信号时, 可以测试步骤5.2 中描述的抗原检索协?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者承认科学生命实验室和卡洛林斯卡研究所提供的基础设施支持。提交人还感谢与 michaela valin、magdalena Otrocka 和 thomas lundbäck 的投入和讨论。
Materials
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Medicago | 09-9400-100 | |
| TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | for detaching cells and subculturing |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | fixative |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody | ThermoFisher Scientific | A11008 | secondary antibody |
| HCS CellMask Red stain | ThermoFisher Scientific | H32712 | Cytoplasm stain |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | 56741 | for permeabilization |
| Hoechst stain 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | nuclear stain |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) – high Glucose | Sigma-Aldrich | 6429 | cell culture media component |
| Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | cell culture media component |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | cell culture media component |
| Corning, breathable plate seal | Sigma-Aldrich | CLS3345 | for copound incubation step |
| Rabbit anti-p38 antibody [E229] | Abcam | ab170099 | primary antibody, LOT:GR305364-16 |
| Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates | VWR | 736-2044 | imaging plates |
| Greiner, 384-well low volume polypropylene plates | VWR | 784201 | |
| Adhesive aluminum foil | VWR | 30127790 | |
| Peelable aluminium seal | Agilent | 24210-001 | for PlateLoc |
| LY2228820 | Selleckchem | S1494 | p38α inhibitor |
| PH797804 | Selleckchem | PH797804 | p38α inhibitor |
| BIRB796 | Selleckchem | S1574 | p38α inhibitor |
| SB203580 | Tocris | 1202 | p38α inhibitor |
| AMG 548 | Tocris | 3920 | p38α inhibitor |
| RWJ 67657 | Tocris | 2999 | p38α inhibitor |
| L-Skepinone | CBCS compound collection | p38α inhibitor | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | blocking agent |
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | BDH | 44244 | used in antigen retrieval |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | used in antigen retrieval |
| A-431 cells | ATCC | ATC-CRL-1555 | |
| Echo 550 | Labcyte | For preparation of compound plates | |
| Plate sealer | Agilent | PlateLoc | |
| Bulk reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | Multidrop Combi |
| Automated liquid handling | Agilent | Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation | |
| Plate washer | Tecan | Hydrospeed | |
| Water bath | Julabo | TW12 | |
| Thermocouple | VWR | Thermocouple traceable lab thermometer | |
| High content imager | Molecular Devices | ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System |
Riferimenti
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