Трехмерная тимическая культурная система для генерации Murine индуцированных Плюрипотентные стволовые клетки полученных Опухолевые антигена конкретных Тимических эмигрантов

Summary

В этой статье описывается новый метод для создания опухолевых антигенов-специфических индуцированных плюрипотентных стволовых клеток полученных тимических эмигрантов (iTE) трехмерной (3D) тимской культуры системы. iTE – это однородное подмножество Т-клеток, тесно связанных с наивными Т-клетками с способностью к пролиферации, формированию памяти и подавлению опухолей.

Abstract

Наследование предварительно переставленных Т-клеточных рецепторов (ТКР) и их эпигенетическое омоложение делают индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) т-клеток перспективным источником для приемной Т-клеточной терапии (ACT). Однако классические методы in vitro для производства регенерированных Т-клеток из iPSC приводят либо к врожденной, либо неизлечимо дифференцированным Т-клеткам, которые фенотипически и функционально отличаются от наивных Т-клеток. Недавно была разработана новая трехмерная (3D) система тимской культуры для создания однородного подмножества CD8-^– антиген-специфических Т-клеток с наивным Т-клеточным функциональным фенотипом, включая способность к распространению, формированию памяти , и подавление опухоли в vivo. Этот протокол позволяет избежать аномальных урядов развития, что позволяет для генерации клинически значимых IPSC полученных Т-клеток, назначенных как iPSC полученных тима эмигрантов (iTE), а также предоставление мощного инструмента для выяснения последующих функций, необходимых для созревания Т-клеток после выбора тимии.

Introduction

Приемная Т-клеточная терапия (ACT) может быть эффективным лечением для некоторых пациентов с запущенным раком. К сожалению, многие пациенты не испытывают регрессии опухоли, и переданные клетки не сохраняются после инфузии. Это может быть связано с качеством настояний Т-клеток. Модель мыши ACT показала, что по сравнению с наивными или менее дифференцированными центральными клетками памяти Т, неизлечимо дифференцированные клетки-эффекторы менее мощные из-за плохой настойчивости in vivo¹, наблюдение также поддерживается клиническими данными^{2, 3}.

В целях повышения эффективности текущего ACT, Т-клеток, полученных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (T-iPSC) были изучены широко^4,5. Когда Т-клетки перепрограммируются в T-iPSC и вновь дифференцированы в Т-клетки, перестроенная конфигурация генов TCR наследуется T-iPSC, а затем и повторно дифференцированных Т-клеток. Таким образом, способность T-iPSC пройти неограниченное расширение in vitro позволяет эффективное размножение незрелых Т-клеток, несущих неоантиген-специфические Т-клеточные рецепторы (TCR), когда такие клетки разработаны из опухолевых антиген-специфических Т-клеток^{6 ,7}. Тем не менее, точный метод дифференциации T-iPSC в зрелые Т-клетки, которые позволили бы производство рака антиген-специфических Т-клеток с менее дифференцированным фенотипом и лучшей противоопухолевой потенцией, еще предстоит выяснить.

T-iPSC дифференциации с использованием совместной культуры OP9 мурин стромальных клеток чрезмерного выражения человека Notch ligand DLL1 является устоявшимся методом для производства Т-клеток в пробирке^6,7. У мышей и людей, эта система совместной культуры может последовательно дифференцировать iPSC, тем самым реквалитулируя события развития от стадии бластоциста до незрелой линии Т-клеток стадии^6,7. Несмотря на эти биотехнологические достижения, физиологическая дифференциация после этапа CD4^иCD8^и двойного положительного (DP) этапа по-прежнему трудно достичь. Одна из причин заключается в том, что in vivo CD4^иCD8^– и CD4^–CD8^– одиночные положительные (SP) Т-клетки генерируются в тимусе, органе, ответственном за созревание и отбор Т-клеток, которые имеют чужую антиген-специфичность, но не автореактивность⁸. Эти селективные процессы определяются как положительный и отрицательный отбор, соответственно. Тем не менее, большинство молекулярных механизмов, необходимых для созревания Т-клеток в тимусе до сих пор полностью не изучены, что затрудняет реконструкцию этого процесса в пробирке. В попытке преодолеть это физиологическое препятствие, несколько групп стимулировали комплекс TCR с использованием анти-CD3 антител или агонист пептидов. Эти методы in vitro генерируют клеточные продукты, которые выражают ключевые маркеры Т-клеток, такие как CD3, CD8, TCR и CD62L, сохраняя при этом специфичность опухолевых антигенов. К сожалению, Т-клетки, генерируемые этими экстрагимичными методами, представляют собой широкую неоднородную популяцию клеток, характеризующуюся неполным положительным отбором, врожденными особенностями, неспецифическим убийством TCR, неспособностью к формированию памяти и непостоянные противоопухолевыеэффекты in vivo 8,^9,10,11. Эти аномалии вызвали опасения, что такие клетки могут вызвать различные побочные эффекты, в том числе лимфомы и кожи и костной аномалии, если используется для терапевтических приложений^12,13,14 .

Чтобы воссоздать физиологические сигналы, отсутствующие в текущих системах дифференциации in vitro, антиген-специфический T-iPSC опухолевого антигена были дифференцированы с помощью собранного тимуса. Классическая система органов тимуса плода (FTOC), которая была разработана для изучения внутритимического развития Т-клеток, была усовершенствована с помощью 3D-системы культуры, которая успешно производила Т-клетки, которые завершили тимическое образование. Эти пост-тимические Т-клетки, которые были обозначены как iPSC полученных тимских эмигрантов (iTE), выставлены наивные свойства¹⁵. iTE показал пролиферацию, формирование памяти и адекватные противоопухолевые эффекты в мышиной модели против установленных опухолей меланомы B16. Эта статья подробно описывает протокол этой новой системы FTOC с использованием 3D-системы культуры(рисунок 1).

Protocol

Все эксперименты на животных были одобрены Институциональными комитетами по уходу за животными и использованию Национального института рака (NCI) и проведены в соответствии с руководящими принципами NIH. 1. Подготовка клеток OP9/DLL1 для совместной культуры с iPSC Культурные клетки OP9/DLL1 в op9-носителях (-минимальная необходимая среда »-MEM» – 20% ненагретная инактивированная сыворотка крупного рогатого скота (FBS) 1x пенициллин-стрептомицин , аскорбиновая кислота (50 нг/мл) и моно-тиоглицерол (100 нм) при 37-c. Когда op9/DLL1 клетки достигают 80-95% конфлюкс, мыть один раз с 1x магния, кальция и фенола красный свободный фосфат буферный солен (в дальнейшем называют PBS). Добавьте 4 мл 0,05% трипсина и инкубировать в течение 5 мин при 37 градусах Цельсия. Затем добавьте 4 мл носителей OP9, разъедините клеточный слой, прокладывая трубку, чтобы сделать одноклеточное суспензию. Перенесите суспензию клетки в коническую трубку 50 мл через 100 мкм-ситечко. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин при 4 градусах По Цельсию, аспирируй супернатант и повторно приостанавливай 12 мл носителей OP9. Плита 2 мл OP9/DLL1 клеточной подвески на новый 10 см клеточной культуры Петри блюдо и добавить дополнительные 8 мл OP9 средств массовой информации. Повторите проход каждые 2-3 дня.ПРИМЕЧАНИЕ: Качество FBS и культурные условия имеют решающее значение для поддержания расширения OP9/DLL1 ячеек, не теряя при этом их способности поддерживать дифференциацию iPSC. Поэтому рекомендуется предварительно оценить много FBS и проход последовательно на 80% confluency для предотвращения клеточной дифференциации и сенесценции. Важно также, чтобы сделать достаточно замороженных запасов OP9/DLL1 клеток и оттаивать новый запас каждые 4-6 недель. 2. В экстракорпорании Дифференциация iPSC в незрелые Т-клетки На 0 день, начните iPSC совместной культуры на OP9/DLL1 конфлированные блюда. Урожай iPSC в виде одноклеточной подвески путем трипсинизации (5 мин в 0,05% трипсина при 37 градусах Цельсия), собирать клетки, и центрифуги на 300 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия. Приготовьте супернатант и отдохните клетки на уровне 1,0 х 105 iPSC на 10 мл носителей OP9. Плита 1.0 x 105 iPSC на соплокую тарелку OP9/DLL1 10 см.ПРИМЕЧАНИЕ: Посуда OP9/DLL1 10 см используется для дифференциации iPSC, когда они достигают 90-100% выпуклости. Различия в стоечности могут повлиять на эффективность дифференциации iPSC. На 3-й день, аспирируйте старые носители и заменить 10 мл свежих носителей OP9. На 6-й день, проходные камеры. Вымойте каждый 10 см сливаOPили OP9 блюдо с 10 мл PBS. Добавьте 3 мл 0,05% трипсина на блюдо и инкубировать в течение 3-5 мин при комнатной температуре (RT). Добавьте 4 мл носителей OP9 и соберите ячейки нежным пипеттингом. Пройдите клетки через 100 мкм ячейки ситечко и центрифуги на 300 х г в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта. Resuspend клетки в 10 мл дифференциации средств (OP9 СМИ с 5 нг /мл мыши Flt3 лиганд “FLT3L” и 5 нг /мл мыши IL-7) и пластины ячейки подвески на новый 10 см OP9/DLL1 слияние блюдо. На 9-й день, аспирации старых носителей и заменить 10 мл свежих средств дифференциации. На 11 день, когда кардиомиоциты наблюдаются в колониях iPSC, механически отсоединяют неадекторные клетки путем пипетки и процеживают через 100 мкм клеточный ситечко. Спин при 300 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию. Аспирация супернатанта и resuspend в 24 мл дифференциации средств массовой информации. Плита iPSC в сливочную 6-колодую пластину OP9/DLL1 (4 мл/колодец). На 15 день, собрать все неприсоединения клеток и фильтр через 40 мкм ячейки ситечко. Спин при 300 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию. Продолжайте пропускать неприсоединения клетки каждые 3-4 дня, повторяя шаг 2.5.1. 3. 3D Тимский орган культуры для создания iTE Урожай мыши плода тимических долей и развертывания эндогенных лимфоцитов по дезоксигуанозина (dGUO) лечение, как ранее описано16. На 7-й день лечения dGUO, возьмите четыре новых 10 см блюд и заполнить каждый с 20 мл полных средств массовой информации (Россвелл Парк Мемориальный институт Сми 1640 “RPMI 1640” (MEM-NEAA) – 1x пенициллин-стрептомицин – 1:1000 2-меркапто этанол). Перенесите все мембраны нитроцеллюлозы с тимическими долей в одну 10-сантиметровую тарелку. Отсоедините отдельные доли от мембраны щипками, что позволяет их погружать в носители. Отбросьте мембраны. Инкубировать 1 ч на RT. Перенесите тимичные доли в новую 10-сантиметровую тарелку с полным носителем и инкубину в течение 1 ч на RT. Повторите этот шаг еще 2 раза. Используя щипцы, исправить тимьяна доли блюдо (по одному в то время), а с другой стороны сделать 100-200 мкм глубокий разрез в центре и расширение половины диаметра доли для облегчения Т-клеток-прародителей миграции в доле. Перенесите тимичные доли в новую 10-сантиметровую тарелку, наполненную полной дифференциацией (полные носители: 5 нг/мл мыши IL-7 , 5 нг/мл мыши FLT3L 5 нг/мл SCF). Дополнительно, при использовании 3D-культурных пластин с сетками нижнего и верхнего уровня, заполните обе сетки стерильными PBS, чтобы предотвратить испарение и сушку висячих капель. Передача 30 злицита полных носителей, содержащих одну дГУообработанную тимику с шага 3,6 в каждую скважину 3D-культурной пластины. Сбор неприсоединения T линии клеток (iPSC полученных незрелых Т-клеток) от OP9/DLL1 совместной культуры (дни 16-21) (шаг 2,6,2) и resuspend на 2-5 х 103 T линейных ячеек на 20 мульти-медиа. Добавьте 20 ЗЛ суспензии тлинейных клеток к каждой тимической доле в 3D-культуре пластины. Инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия с 5% CO2. Установите P200 pipet до 30 Зл и аспирировать средства массовой информации после pipetting несколько раз из каждого колодца, чтобы удалить все клетки, окружающие тимские доли. Отбросьте мультимедиа и добавьте 30 кл. полного носителя. Повторите эту процедуру 5-7 раз, чтобы удалить любые дополнительные незрелые Т-клетки, которые не мигрируют в доли. Изменение 25-30 Зл средств массовой информации ежедневно после этого. Подтвердите образование ореола тимических эмигрантов (iTE) по липучне, полученного в iTE, вокруг долей, начиная с 4-5 дня, с помощью световой микроскопии. Собирайте iTE ежедневно путем пипетки средств массовой информации без нарушения доли. Изменяйте носители каждый день и продолжайте сбор примерно до 12 дней. Собранные iTE готовы к использованию для молекулярного анализа(рисунок 2, Рисунок3, Рисунок 4, и Рисунок 5) или in vivo экспериментов по трансплантации. 4. Подготовка антигенных клеток (APC) Пожертвуйте мышью C57BL/6 путем вывиха шейки матки и поместите на лабораторный коврик, как описано выше. Удалите селезенку и поместите ее на 100 мкм ячейки ситечко. Сжать селезенку на ситечко с помощью 12 мл шприц поршень, чтобы сделать одну ячейку подвески. Перенесите суспензию клетки через стерильный 40 мкм-ситечко. Centrifuge подвески на 300 х г в течение 5 минут при 4 кв С, чтобы гранулы клеток. Усилите супернатант и повторно ежеклеточные гранулы в 2 мл лиза аммония-хлорида (ACK), чтобы исключить эритроциты (РБК). Инкубировать в течение 5 мин на RT. Утолить буфер lysis ACK, добавив 10 мл PBS. Пелле клетки центрифугации при 300 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия. Аспирировать супернатант и resuspend клеточной гранулы в 10 мл полного носителя и передачи 10 см стерильной чашке Петри. Облучение спленоцитов с помощью 3500 рад с помощью облучения устройства (я-излучения) для предотвращения пролиферации клеток. Немедленно верните облученные клетки в инкубатор и культуру 37 градусов по Цельсию на ночь. Используйте облученные ячейки в качестве БТР или замораживание в ячейке банкира. 5. Пульсирующий БТР с антигеном Граф жить облученных БТР с помощью гемоцитометра Нойбауэр и trypan синий краситель. Инкубировать APC с пептидами (hgp100) или нуклеопротеином в течение 30 мин при 37 градусах Цельсия. Вымойте APC дважды с 10 мл PBS, чтобы удалить любой дополнительный пептид. Подсчитайте iTE и смешайте с БТР в соотношении 1:1 в полных носителях с 100 МЕ Ил-2 и 5 нг/мл Ил-7. Aliquot 100 л смеси клеток (общая концентрация: 1 х 106 клеток/мл) в каждую скважину ультра-низкой привязанности U bottom 96 хорошо пластины и культуры для 48 ч при 37 градусов по Цельсию. После 48 ч, передача клеток на новую пластину с помощью многоканального пипетки и проход каждые 2-3 дней после этого. На 3-й день проанализируйте профиль секреции цитокинов, окрашивая клетки внутриклеточными антителами и анализируйте с помощью цитометрии потока(рисунок 3). Добавьте 0,67 л/мл ингибитора переноса белка (например, GolgiStop) и инкубировать при 37 градусах По цельсии в течение 6 ч для усиления внутриклеточного накопления цитокинов. Вымойте 10 мл PBS. Приостановите работу клеток в 3 мл холодного (4 кВ) PBS и медленно добавьте 1 мл холодного 4% параформальдегида (PFA). После 10 мин, спина вниз клетки на 300 х г в течение 5 мин при 4 кв С, отбросить супернатант и вымыть с 10 мл PBS. Переплетить клетки в 1 мл PBS – 1% FBS – 0,1% неионического сурфактанта, и поместить в 4 кв. м в течение 10-15 мин. Добавить антитела, защитить образцы от света и поместить в 4 градуса по Цельсию в течение 30 мин. Спин вниз клетки на 300 х г в течение 5 минут при 4 кв С, отбросить супернатант, и мыть с 10 мл PBS. Спин вниз клетки на 300 х г в течение 5 минут при 4 КС и resuspend клеток в 1 мл PBS. Клетки готовы к анализу в цитометре потока.

Representative Results

Co-культурные тимы плода были разделены для анализа ли iPSC полученных T линии клетки могут мигрировать в тимачных долей. Unseeded контрольные доли были ткани архитектуры характеризуется астроцитов, как тимский эпителиальной сети17, развернутые эндогенных КЛЕТОк CD3. С другой стороны, тимические доли, посеянные с immature T-клетками, полученными iPSC, были заселены моноядерными клетками CD3 и, что указывает на миграцию незрелых Т-клеток, полученных iPSC, в доли (рисунок2A). Т-клетки, которые мигрировали и созрели в тимской микросреде, впоследствии выбыли как iTE. Чтобы проверить их фенотипической характеристики, поток цитометрического анализа C57BL6 тимоцитов, Pmel iPSC полученных незрелых Т-клеток (экстратимные), и клетки, которые выйти из тимических долей (iTE) было выполнено. Экстратимные Т-клетки на OP9/DLL1 показали CD4иCD8 (DP) Т-клетки и Т-клетки CD8’SP без выражения положительного маркера отбора MHC-I, в то время как iTE имела четкую популяцию CD8’SP MHC-Iи Т-клеток фенотипа, указывая на их успешный проход через положительный отбор до выхода из тимических долей. iTE последовательно выражают MHC-I и CD62L, которые являются маркерами, связанными с высокой пролиферативной компетентности, производством цитокинов, периферийным выживанием и лимфоидным самонаведением18,19,20. Этот фенотип согласуется с M2 SP тимоцитов, которые являются наиболее зрелой популяции одного положительных Т-клеток в тимуса20, что свидетельствует о том, что iTE перешли через нормальную тимическую программу развития (Рисунок 3). Для контроля эффективности генерации iTE были выделены клетки, выпавшие из отдельных тимических долей. На 7-й день, тимики доли генерируется в среднем 1 х 103 жить CD8SP CD45.1CD3 cd3iTE в день (рисунок3B). Аналогичный уровень производства iTE наблюдается со дня 6 до дня 12 3D тимской ко-культуры. Антиген-зависимая активация и секреция цитокинов были проанализированы для наблюдения за функциональными свойствами тимически образованных незрелых Т-клеток, полученных от iPSC. При наличии нерелевантного пептида (нуклеопротеина) Пмель-иТЕ не высвобождавал значительное количество ТНФ-З, ИЛ-2 или ИФН-З. При стимуляции с коньячным пептидом для клеток Pmel T (hgp100), Пмель-iTE выпустила надежное количество ТНФ-Я и IL-2, а также производит небольшое количество IFN-Я (Рисунок 4), что свидетельствует о том, что тимически образованных iTE может распознать их коньяк пептид и секретный эффектор цитокинов с профилем, напоминающим профиль естественных недавних тимских эмигрантов (RTE). Для изучения транскрипционных различий между iPSC-полученных T линейных клеток дифференцированных на OP9/DLL1 с или без тимического образования (т.е. iTE против экстратимных Т-клеток), РНК-сек анализ был выполнен на этих двух популяций и по сравнению к клеткам линии DP T, дифференцированным с помощью OP9/DLL1 (DP) и первичных наивных CD8и Pmel T-клеток. Выражение 102 генов, которые играют решающую роль в Т-клеток онтогена, тимоцитов активации, и формирование памяти были проанализированы15,20,21,22. Основной компонент анализа этих четырех изученных популяций показал, что экстратимически генерируемые DP и CD8SP T-клетки сгруппированы вместе, в то время как iTE сгруппированы ближе к наивным Т-клеткам(рисунок 5). В совокупности эти данные показывают, что iTE имеет фенотип ближе к наивным Т-клеткам, чем т-линии клеток, генерируемых экстратимическими методами. Рисунок 1 : Схематический обзор дифференциации iPSC к iTE с использованием OP9/DLL1 и 3D тимической культуры. Протокол включает в себя три отдельных шага дифференциации; (Слева) от клеток iPSC к гематопоитетической линии клеток на OP9/DLL1 (день от 0 до 6), (Средний) от гематопоиетических клеток линии до незрелых Т-клеток на OP9/DLL1 с цитокинов (день 6 до 16-21), и (справа)от незрелых Т-клеток (день 16-21) до iTE с использованием 3D тимической системы культуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 2 : Иммуногистохимия тимических долей, посеянных с незрелыми Т-клетками, полученными iPSC. Вверху: H и E окрашивание тимической доли с и без посева iPSC полученных незрелых Т-клеток. От второго сверху вниз: конфокальные изображения разделенных долей, окрашенных DAPI (ядро), CD3 (T ячейка), и слияния. Шкала баров 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.  Рисунок 3 : iTE показывает посттимичный фенотип Т-клеток. (A) АНАЛИЗы FACS тимоцитов, экстрагимических Т-клеток (система сокультуры OP9/DLL1) и Pmel-iTE. Клетки в живых клетках были закрыты на конгенивных CD45. Популяции CD8 SP были дополнительно проанализированы для выражения CD62L и MHC-I. (B) Среднее количество CD8SP CD45.1 iTE производится на ночь на доли 7 дней после предварительного посева. Данные были собраны в ходе 12 независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.  Рисунок 4 : iTE производят различные цитокины путем антиген-специфической стимуляции. FACS анализирует внутриклеточную выработку цитокинов iTE. iTE были совместно культивированы с БТР предварительно загружены нерелевантных (нуклеопротеин) или коньяк (hgp100) пептид в течение трех дней. Цифры, показанные в верхних правых квадрантах, указывают на проценты iTE, производящего цитокин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.  Рисунок 5 : Анализ всего транскриптома показывает сдвиг в экспрессии гена iTE в сторону наивного CD8 + T-клеточная программа. Принцип анализа компонентов (PCA) данных РНК-сек из DP, экстратимических CD8 SP, iTE и наивных Т-клеток. (Анализ 102 генов, связанных с тимической дифференциацией с использованием общедоступной базы данных GSE105110) 15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. 

Discussion

Использование T-iPSC для регенерации опухолевых антиген-специфических Т-клеток может преодолеть многие из нынешних препятствий ACT путем создания молодых клеток с улучшенной настойчивостью. Хотя несколько методов с использованием OP9/DLL1 совместной культуры системы, как сообщается, генерировать CD8 SP-клеток^6,7,10,^13, которые выражают CD8 молекул и опухолевых антигенов конкретных TCRs, глобальный ген шаблоны выражения и функциональный анализ показывают, что эти экстратимически регенерированные клетки CD8 SP отличаются от наивных Т-клеток(рисунок 4). Здесь мы описываем 3D тимическую систему культуры, которая может генерировать iPSC полученных тимических эмигрантов (iTE) с высокой точностью и однородность из murine T-iPSC. iTE напоминают наивные Т-клетки в глобальной модели экспрессии генов и в функциональности, таких как формирование памяти и противоопухолевый эффект in vivo против установленной опухоли¹⁵.

Классическая система FTOC является способом повторения тимического отбора in vitro. Он был использован для изучения внутритимического развития тимоцитов²³, и Есть несколько сообщений fTOC используется для создания RTE²⁴. Тем не менее, система FTOC имеет ряд ограничений. Для того чтобы отсутсвие кислорода в искусственничной культуре органа, несколько групп использовали или semi-сухую культуру основанной мембраны^23,или системы культуры субмерии кислорода^25. Однако никакие современные методы не могут постоянно генерировать однородную популяцию посттимических Т-клеток. Чтобы преодолеть ограничения классической системы FTOC, мы разработали 3D тимическую систему культуры, которая обеспечивает технические усовершенствования по сравнению с обычными методами¹⁵. Например, использование нашего метода 3D тимической культуры, максимального обмена кислородом и отсутствия поверхностно-логов механического стресса держать тимские доли в более физиологической среде. Кроме того, долгосрочная культура позволяет зрелым Т-клеткам естественным образом выйти из тимических долей. Наконец, наблюдение в реальном времени и микроманипуляции позволяют обмениваться средствами массовой информации и постоянной коллекции iTE без физического нарушения тимических долей. Таким образом, метод 3D тимической культуры обеспечивает значительные технические усовершенствования, а также возможность изучения тимически выбранных наивных Т-клеток, которые ранее не были доступны.

Есть несколько ключевых моментов для успешного поколения iTE с помощью этой 3D тимской системы культуры. Качество УСЛОВИй FBS и культуры имеет решающее значение для поддержания расширения OP9/DLL1 ячеек, не теряя при этом их способности поддерживать дифференциацию iPSC. Поэтому мы рекомендуем предварительной оценки fbS много, а также последовательно прохождения на 80% confluency для предотвращения клеточной дифференциации и сенесценции. Кроме того, культура слияния OP9/DLL1 необходима для дифференциации iPSC в незрелые Т-клетки, так как различия в выпуклости могут повлиять на их эффективность. Наконец, эмбриональный возраст тимических долей имеет решающее значение для поколения iTE. Рекомендуем использовать E14.5 – 15,5 тыс. долей.

Как и в случае с любым новым протоколом, этот метод имеет ограничения и подлежит совершенствованию. Представленная здесь техника культуры в течение двух недель составляет около 1000 iTE на тимическую мебу. Увеличение генерации iTE может быть возможно с дальнейшими изменениями, включая оптимизацию концентрации кислорода, объема мультимедиа и типа 3D-культурной пластины. Добавление или удаление цитокинов, а также изменения концентрации цитокинов, также может способствовать повышению урожайности iTE.

Учитывая, что 3D тимическая система культуры, представленная здесь, может генерировать тимических эмигрантов в полностью ex vivo системы, этот метод может быть применен к различным иммунологических и приемных клеток передачи научно-исследовательских проектов, включая, но не ограничивайтесь T дифференциация клеток, посттимичное созревание Т-клеток и генерация антиген-специфических Т-клеток гематопоиетического прародителя или стволовых клеток. Хотя этот метод непосредственно не применим к пробам человека, iTE и система 3D тимской культуры имеют большой потенциал для выяснения молекулярных механизмов положительного и отрицательного отбора и могут способствовать созданию системы культуры, которая позволяет поколение клинически релевантных опухолевых антигенов конкретных наивных Т-клеток для АКТ.

Materials

Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins
2-deoxyguanosine	Sigma-Aldrich	312693-72-4
2-Mercaptoethanol (1000X)	Thermo Fisher Scientific	21985-023
ACK Lysing Buffer	Gibco	A1049201
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A8960
Blasticidin	Thermo Fisher Scientific	R21001
FBS	Gemini	100-500
Flt-3 ligand	R&D Systems	427-FL
GlutaMAX (100X)	Thermo Fisher Scientific	35050-061
hgp100	Genscript	282077-1, KVPRNQDWL
Interleukin-2	R&D Systems	402-ML
Interleukin-7	R&D Systems	407-ML
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
MEM powder	Gibco	61100061
Monothioglycerol	Sigma-Aldrich	M-6145
Nucleoprotein	Global Peptides	ASNENMETM
Penicillin/streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-122
Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x)	Thermo Fisher Scientific	10010-023
Puromycin	Thermo Fisher Scientific	A1113803
RPMI 1640	Gibco	11875093
Sodium Pyruvate	Thermo Fisher Scientific	11360-070
Stem Cell Factor (SCF)	R&D Systems	455-MC
Stemfactor LIF, Mouse Recombinant	STEMGENT	03-0011-100
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300-062
Cell Culture Vessels and others
10 cm dish	Corning, Inc.	353003
12ML Syringe	Covidien Monoject	22-652-090
6 well plate	Corning/Coster	3516
Cell strainer 100um	Fisher Scientific	22-363-549
Cell strainer 40um	Fisher Scientific	22-363-547
Forceps	DUMONT	0108-5PO
Lab soaker mat	Versi-Dry	Cat. EF2175CX 74018-00
Membrane filters ( 0.8 μm, 47diam)	Whatman	WHA7408004 ALDRICH
Perfecta3D Hanging Drop Plate	Sigma-Aldrich	HDP1096
U Bottom 96 well plate	Corning/Coster	3799
Experimental Cell lines
CD3-iPSC	Vizcardo et al., Cell Report 2018	N/A
MEF-iPSC	Vizcardo et al., Cell Report 2018	N/A
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF)	ATCC	SCRC-1040; RRID:MGI:5007926
OP9/N-DLL1	Riken Bioresource center	Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220
Pmel-iPSC	Vizcardo et al., Cell Report 2018	N/A
Experimental mouse models
B6.SJL-PtprcaPepcb/BoyCrCrl	Charles River	Strain Code 564; RRID:IMSR_CRL:564
C57BL/6N	NCI/Charles River	N/A
Pmel-1 mice	Overwijk et al.	J Exp Med 198(4):569-80
Antibodies
Anti-aTCR	Biolegend	109202; RRID:AB_313425
Anti-CD3	abcam	ab11089; RRID:AB_369097
Anti-CD4	BD Biosciences	553730; RRID:AB_395014
Anti-CD44	BD Biosciences	559250; RRID:AB_398661
Anti-CD45.1	BD Biosciences	553775; RRID:AB_395043
Anti-CD45.2	BD Biosciences	553772; RRID:AB_395041
Anti-CD62L	BD Biosciences	560516; RRID:AB_1645257
Anti-CD69	BD Biosciences	552879; RRID:AB_394508
Anti-CD8a	BD Biosciences	557959; RRID:AB_396959
Anti-CD8b	BD Biosciences	550798; RRID:AB_393887
Anti-H-2Kb	BD Biosciences	553570; RRID:AB_394928
Anti-IFN-g	BD Biosciences	557998; RRID:AB_396979
Anti-IL-2	BD Biosciences	554428; RRID:AB_395386
Anti-TCRb	Thermo Fisher Scientific	35-5961-81; RRID:AB_469741
Anti-TCRVb13	BD Biosciences	553204; RRID:AB_394706
Anti-TNFa	BD Biosciences	557644; RRID:AB_396761