Denne artikel beskriver en ny metode til at generere tumor antigen-specifikke induceret pluripotente stamcelle-afledte thymisk emigranter (iTE) af en tredimensionel (3D) thymisk kultur system. iTE er en homogen delmængde af T-celler tæt relateret til naive T-celler med kapacitet til spredning, hukommelse dannelse, og tumor suppression.
Arv af præ-omarrangerede T celle receptorer (TCRs) og deres epigenetiske foryngelse gøre induceret pluripotente stamcelle (iPSC)-afledte T-celler en lovende kilde til adoptivt celleterapi (ACT). Klassiske in vitro-metoder til fremstilling af regenererede T-celler fra iPSC resulterer dog i enten medfødte eller terminalt differentierede T-celler, som er phenotypisk og funktionelt adskilte fra naive T-celler. For nylig blev et nyt tredimensionelt (3D) thymisk kultur system udviklet til at generere en homogen delmængde af CD8αβ+ antigen-specifikke t-celler med en naiv t celle-lignende funktionel fænotype, herunder kapaciteten til spredning, hukommelses dannelse og tumor suppression in vivo. Denne protokol undgår afvigende udviklingsmæssige skæbner, der muliggør generering af klinisk relevante iPSC-afledte T-celler, udpeget som iPSC-afledte thymiske emigranter (iTE), samtidig med at der gives et potent værktøj til at belyse de efterfølgende funktioner, der er nødvendige for T celle modning efter thymisk udvælgelse.
Adoptiv T celleterapi (ACT) kan være en effektiv behandling for nogle patienter med fremskreden kræft. Desværre, mange patienter oplever ikke tumorregression, og overførte celler undlader at fortsætte efter infusion. Dette kan skyldes kvaliteten af de inbrugte T-celler. En ACT-musemodel viste, at i forhold til naive eller mindre differentierede centrale hukommelses-T-celler er terminalt differentierede Effector-celler mindre potente på grund af dårlig in vivo-persistens1, en observation, der også understøttes af kliniske data2, 3.
I et forsøg på at forbedre effekten af den nuværende handling, t celle-afledte inducerede pluripotente stamceller (t-IPSC) er blevet undersøgt i udstrakt grad4,5. Når T-celler omprogrammeres til T-iPSC og re-differentieret i T-celler, nedarves den omarrangerede konfiguration af TCR-gener af T-iPSC og efterfølgende de re-differentierede T-celler. Derfor giver T-iPSC mulighed for ubegrænset in vitro-ekspansion en effektiv reproduktion af umodne T-celler, der bærer de neoantigen-specifikke T-celle receptorer (TCR), når sådanne celler er konstrueret fra tumor antigen specifikke T-celler6 ,7. Men den præcise metode til differentiering af T-iPSC i modne T-celler, som ville gøre det muligt at fremstilling af kræft antigen-specifikke T-celler med en mindre differentieret fænotype og bedre anti-tumor styrke, er stadig at blive belyst.
T-IPSC differentiering beskæftiger Co-kultur af OP9 murine stromale celler over-udtrykker menneskelig notch ligand filen dll1 er en veletableret metode til at producere T-celler in vitro6,7. I mus og mennesker, kan dette Co-kultur system konsekvent differentiere IPSC, og dermed rekapitulere udviklingsmæssige begivenheder fra blastocyst scenen indtil den umodne T Cell Lineage fase6,7. På trods af disse bioteknologiske fremskridt er den fysiologiske differentiering efter CD4+CD8+ Double positive (DP)-stadiet stadig svær at opnå. En af grundene er, at in vivo CD4+CD8– og CD4–CD8+ enkelt positive (SP) T celler genereres i thymus, et organ med ansvar for modning og udvælgelse af T-celler, der har fremmede antigen-specificitet, men ikke auto-reaktivitet8. Disse selektive processer defineres som henholdsvis positivt og negativt valg. Men de fleste af de molekylære mekanismer, der er nødvendige for at modne T-celler i thymus, er stadig ikke fuldt forstået, hvilket gør det vanskeligt at rekonstruere denne proces in vitro. I et forsøg på at overvinde denne fysiologiske hurdle, flere grupper har stimuleret TCR kompleks ved hjælp af anti-CD3 antistoffer eller agonist peptider. Disse in vitro-teknikker genererer celleprodukter, som udtrykker vigtige T-celle markører, som CD3, CD8αβ, TCRαβ og CD62L, mens de stadig bevarer tumor antigen-specificitet. Desværre, T-celler genereret af disse extrathymic metoder udgør en bred heterogene population af celler karakteriseret ved ufuldstændig positiv udvælgelse, medfødte-lignende funktioner, TCR ikke-specifikke drab, manglende evne til hukommelse dannelse, og ikke-persistente anti-tumor effekter in vivo8,9,10,11. Disse anomalier har givet anledning til bekymring for, at sådanne celler kan udløse en række bivirkninger, herunder lymfom og både hud-og knogle anomalier, hvis de anvendes til terapeutiske anvendelser12,13,14 .
For at genskabe de fysiologiske signaler, der mangler i de nuværende in vitro-differentierings systemer, blev tumor antigen-specifik T-iPSC differentieret ved hjælp af en høstet thymus. Den klassiske føtale thymus organ kultur (ftoc) system, som var designet til at studere intra-thymisk udvikling af t-celler, blev forbedret ved hjælp af en 3D-kultur system, som med succes producerede t-celler, der afsluttede thyminsyre uddannelse. Disse post-thymiske T-celler, som blev udpeget som iPSC-afledte thymiske emigranter (iTE), udviste naive lignende egenskaber15. iTE viste spredning, hukommelse dannelse, og passende anti-tumor effekter i en musemodel mod etablerede B16 melanom tumorer. Denne artikel beskriver i detaljer protokollen for denne roman FTOC system ved hjælp af en 3D kultur system (figur 1).
Ved hjælp af T-iPSC at regenerere tumor antigen-specifikke T-celler kan overvinde mange af de nuværende forhindringer af ACT ved at generere unge celler med forbedret vedholdenhed. Selv om flere metoder ved hjælp af OP9/filen dll1 Co-kultur system er blevet rapporteret til at generere CD8 SP-celler6,7,10,13 , der udtrykker CD8 molekyler og tumor antigen-specifikke tcrs, global gen udtryks mønstre og funktionel analyse viser, at disse extrathymically regenereret CD8 SP-celler er forskellige fra naive T-celler (figur 4). Her beskriver vi et 3D-thymisk kultur system, der kan generere iPSC-afledte thymiske emigranter (iTE) med høj pålidelighed og homogenitet fra murine T-iPSC. iTE ligne naive T-celler i globale genekspression mønster og i funktionalitet, såsom hukommelse dannelse og in vivo anti-tumor effekt mod etablerede tumor15.
Det klassiske FTOC-system er en måde at rekapitulere thymisk udvælgelse in vitro. Det har været brugt til at studere intra-thymisk udvikling af thymocytter23, og der er et par rapporter om ftoc bliver brugt til at generere rte24. FTOC-systemet har dog flere begrænsninger. For at håndtere den manglende ilt i en kunstig organ kultur, har flere grupper brugt enten en semi-tør membranbaseret kultur23, eller høj ilt nedsænkning kultur systemer25. Men, ingen nuværende metoder kan konstant generere en homogen population af post-thymic T-celler. For at overvinde begrænsningerne i det klassiske FTOC-system designede vi et 3D-thymisk kultur system, der giver tekniske forbedringer i forhold til konventionelle metoder15. For eksempel, ved hjælp af vores 3D thyminsyre kultur metode, maksimal ilt udveksling og fraværet af overflade-lap mekanisk stress holde thyminsyre lapper i et mere fysiologisk miljø. Derudover tillader langsigtet kultur modne T-celler at udgå naturligt fra de thymiske lobes. Endelig muliggør realtids observation og mikromanipulation medieudveksling og en konstant samling af iTE uden fysisk at forstyrre de thymiske lapper. Således giver 3D thyminsyre-dyrkningsmetoden betydelige tekniske forbedringer samt en mulighed for at studere thymidisk udvalgte naive T-celler, der ikke tidligere var tilgængelige.
Der er flere vigtige punkter for den vellykkede generation af iTE ved hjælp af denne 3D thyminsyre kultur system. Kvaliteten af FBS og kulturforhold er afgørende for at opretholde udvidelsen af OP9/filen DLL1 celler uden at miste deres evne til at støtte iPSC differentiering. Derfor anbefaler vi præ-evaluering af FBS-partiet samt konsekvent passaging ved 80% konfluency for at forhindre Celledifferentiering og senescens. Derudover kræves der en flydende OP9/filen dll1-kultur til in vitro -differentiering af IPSC i umodne T-celler, da forskelle i konfluency kan påvirke deres effektivitet. Endelig er den foster alder af thyminsyre lapper afgørende for generering af iTE. Vi anbefaler at bruge e 14.5-15,5 thyminsyre lobes.
Som med enhver ny protokol, denne metode har begrænsninger og er underlagt forbedringer. Den kultur teknik, der præsenteres her, genererer ca. 1000 iTE pr. thymisk lap pr. dag i en periode på to uger. Øget iTE generation kan være muligt med yderligere ændringer, herunder optimering af ilt koncentration, medie volumen, og type af 3D kultur plade. Tilsætning eller fjernelse af cytokiner samt ændringer i cytokinkoncentrationen kan også bidrage til forbedret iTE-udbytte.
Da det 3D-thymiske kultur system, der præsenteres her, kan generere thymisk emigranter i et helt ex vivo -system, kan denne teknik anvendes på en række immunologiske og adoptivcelle overførsels forskningsprojekter, herunder, men ikke begrænset til, T Celledifferentiering, post-thymisk T-celle modning og generering af antigen specifikke T-celler fra hæmatopoietiske stamceller. Selv om denne metode ikke er direkte anvendelig på humane prøver, iTE og 3D thyminsyre kultur system har et stort potentiale for at belyse de molekylære mekanismer af positive og negative udvælgelse og kan lette skabelsen af et kultur system, der gør det muligt generation af klinisk relevante tumor antigen-specifikke naive-lignende T-celler for ACT.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Hiroshi Kawamoto og Kyoko Masuda for venligst at give OP9/filen DLL1 Cell line. Vi takker Alan B. Hoofring og Erina Z. Han for grafisk assistance. Denne forskning blev støttet af Intramural Research program af US National Cancer Institute (ZIA BC010763) og cancer Moonshot program for Center for celle-baserede terapi på NIC, NIH. Arbejdet blev også støttet af Milstein Family Foundation.
Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
2-deoxyguanosine | Sigma-Aldrich | 312693-72-4 | |
2-Mercaptoethanol (1000X) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A8960 | |
Blasticidin | Thermo Fisher Scientific | R21001 | |
FBS | Gemini | 100-500 | |
Flt-3 ligand | R&D Systems | 427-FL | |
GlutaMAX (100X) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
hgp100 | Genscript | 282077-1, KVPRNQDWL | |
Interleukin-2 | R&D Systems | 402-ML | |
Interleukin-7 | R&D Systems | 407-ML | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
MEM powder | Gibco | 61100061 | |
Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | |
Nucleoprotein | Global Peptides | ASNENMETM | |
Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
Sodium Pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
Stem Cell Factor (SCF) | R&D Systems | 455-MC | |
Stemfactor LIF, Mouse Recombinant | STEMGENT | 03-0011-100 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 | |
Cell Culture Vessels and others | |||
10 cm dish | Corning, Inc. | 353003 | |
12ML Syringe | Covidien Monoject | 22-652-090 | |
6 well plate | Corning/Coster | 3516 | |
Cell strainer 100um | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
Cell strainer 40um | Fisher Scientific | 22-363-547 | |
Forceps | DUMONT | 0108-5PO | |
Lab soaker mat | Versi-Dry | Cat. EF2175CX 74018-00 | |
Membrane filters ( 0.8 μm, 47diam) | Whatman | WHA7408004 ALDRICH | |
Perfecta3D Hanging Drop Plate | Sigma-Aldrich | HDP1096 | |
U Bottom 96 well plate | Corning/Coster | 3799 | |
Experimental Cell lines | |||
CD3-iPSC | Vizcardo et al., Cell Report 2018 | N/A | |
MEF-iPSC | Vizcardo et al., Cell Report 2018 | N/A | |
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | ATCC | SCRC-1040; RRID:MGI:5007926 | |
OP9/N-DLL1 | Riken Bioresource center | Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220 | |
Pmel-iPSC | Vizcardo et al., Cell Report 2018 | N/A | |
Experimental mouse models | |||
B6.SJL-PtprcaPepcb/BoyCrCrl | Charles River | Strain Code 564; RRID:IMSR_CRL:564 | |
C57BL/6N | NCI/Charles River | N/A | |
Pmel-1 mice | Overwijk et al. | J Exp Med 198(4):569-80 | |
Antibodies | |||
Anti-aTCR | Biolegend | 109202; RRID:AB_313425 | |
Anti-CD3 | abcam | ab11089; RRID:AB_369097 | |
Anti-CD4 | BD Biosciences | 553730; RRID:AB_395014 | |
Anti-CD44 | BD Biosciences | 559250; RRID:AB_398661 | |
Anti-CD45.1 | BD Biosciences | 553775; RRID:AB_395043 | |
Anti-CD45.2 | BD Biosciences | 553772; RRID:AB_395041 | |
Anti-CD62L | BD Biosciences | 560516; RRID:AB_1645257 | |
Anti-CD69 | BD Biosciences | 552879; RRID:AB_394508 | |
Anti-CD8a | BD Biosciences | 557959; RRID:AB_396959 | |
Anti-CD8b | BD Biosciences | 550798; RRID:AB_393887 | |
Anti-H-2Kb | BD Biosciences | 553570; RRID:AB_394928 | |
Anti-IFN-g | BD Biosciences | 557998; RRID:AB_396979 | |
Anti-IL-2 | BD Biosciences | 554428; RRID:AB_395386 | |
Anti-TCRb | Thermo Fisher Scientific | 35-5961-81; RRID:AB_469741 | |
Anti-TCRVb13 | BD Biosciences | 553204; RRID:AB_394706 | |
Anti-TNFa | BD Biosciences | 557644; RRID:AB_396761 |