Denne trinnvise protokollen gir en detaljert beskrivelse av eksperimentelle oppsett og dataanalyse for vurdering av inflammatoriske svar i hiPSC-ECs og analyse av leukocytter vedheft under fysiologiske flyt.
Endotelceller (ECs) er avgjørende for regulering av provoserende svar begrense eller tilrettelegge leukocytter rekruttering til berørte vev via en godt karakterisert kaskade av Pro lim reseptorer som er upregulated på den leukocytter celleoverflaten på inflammatorisk utløseren. Inflammatorisk svar varierer mellom individer i befolkningen og genetisk bakgrunnen kan bidra til disse forskjellene. Menneskelige indusert pluripotent stamceller (hiPSCs) har vist seg å være en pålitelig kilde til ECs (hiPSC-ECs), dermed representerer en ubegrenset kilde av celler som fange genetisk identiteten og genetisk varianter eller mutasjoner av donor. hiPSC-ECs kan derfor brukes til modellering inflammatorisk svar i donor-spesifikke celler. Inflammatorisk svar kan modelleres ved å bestemme leukocytter vedheft til hiPSC-ECs under fysiologiske flyt. Denne trinnvise protokollen gir en detaljert beskrivelse av eksperimentelle oppsett og dataanalyse for vurdering av inflammatoriske svar i hiPSC-ECs og analyse av leukocytter vedheft under fysiologiske flyt.
Betennelse spiller en sentral rolle i mange pathological betingelser, inkludert hjerte og nevrodegenerative lidelser, sepsis og ugunstige narkotika svar (ADR). Endotelceller (ECs) spiller en viktig rolle i å regulere inflammatorisk svar via induksjon av Pro lim reseptorer, som E-selectin, intercellulær adhesjon molekyl-1 (ICAM-1) og vascular celle vedheft molekyl-1 (VCAM-1) på overflaten deres 1 , 2. mikrovaskulær ECs i ulike vev er kjent for å ha heterogenitet i inflammatorisk svar3,4. Videre kan genetisk bakgrunn eller enkelte genetisk resultere i forskjeller i inflammatorisk svar mellom individer; Det er derfor viktig å ha tilgang til ECs fra ulike individer. Mer nylig menneskelige indusert pluripotent stamceller (hiPSCs)5, som kan utledes fra nesten alle individ, ble vist som en pålitelig og fornybar kilde ECs6,7,8, 9. derfor vurdering av inflammatorisk respons og leukocytter rekruttering i hiPSC-ECs er verdifull, ikke bare for modellering av visse genetiske lidelser, men også å gi indikasjoner på Inter-individuelle variasjon og bruke som et verktøy for personlig medisin i fremtiden.
Flyt analyser gir et nyttig verktøy for å studere endothelial-leukocytter interaksjon. Fremskritt innen microfluidic enheter kan gjengivelse av fysiologiske strømningsforhold med nøyaktig kontroll av vaskulær seng-spesifikke skjæring stress nivåer. Live bildebehandling kan overvåking av kaskade av hendelser av leukocytter fange, rullende, gjennomgang, vedheft og transmigration. Flere flyt analyser å studere endothelial-leukocytter interaksjon har blitt utviklet, men de alle bruker primære ECs10,11,12,13. Her vil vi beskrive i detalj analysen for vurdering av menneskelig leukocytter vedheft til hiPSC-ECs under fysiologiske flyt. Her beskriver vi optimalisert betingelser for hiPSC-EC stimulering med pro-inflammatoriske stimuli, som tumor nekrose faktor alpha (TNFα), dissosiasjon, såing i microfluidic brikke med åtte parallelle kanaler. Vi beskriver en trinnvis protokoll for perfusjon av hiPSC-ECs av fluorescently merket leukocytter microfluidic sjetonger, live celle bildebehandling og automatisert telling av tilhenger leukocytter.
Denne protokollen er nyttig for vurdering av inflammatoriske svar i hiPSC-ECs i narkotikarelaterte screening, sykdom modellering og personlig regenerativ medisin.
Denne protokollen beskriver karakterisering av hiPSC-EC behandling med pro-inflammatoriske stimuli, som TNFα, funksjonell vurdering av leukocytter vedheft til hiPSC-ECs i flyt analysen bruker live bildebehandling og automatiserte teller av tilhenger leukocytter.
Overnatting stimulering av hiPSC-ECs med TNFα resulterer i avlange utseendet som vanligvis angir en aktivert pro-inflammatoriske fenotypen i ECs. Under optimalisering scenen, uttrykk nivåer av E-selectin, ICAM-1, VCAM-1 må verifiseres av FACs7,8og primære menneskelige umbilical blodåre ECs (HUVECs) er tilrådelig å inngå som positive kontroller.
Optimal hiPSC-ECs dissosiasjon og seeding tetthet skal nås for å oppnå en confluent monolayer uten å danne celle klumper og kanal tresko. Det er viktig å suspendere leukocytter rett før perfusjonsmåling for å unngå celle nedbør og opprettholde en konstant konsentrasjon når assaying hver kanal. Menneskelige perifert blod leukocytter, som monocytter og nøytrofile kan brukes eller etablert monocytic linjer, som THP-1 eller HL-60 kan brukes som et alternativ.
Da microfluidic oppsettet og under flyt analysen er det avgjørende å unngå luftbobler fra å bli fanget i microfluidic rør og kanaler som de kan medføre brøkdel av hiPSC-ECs og/eller tilhenger leukocytter. Væske-til-væske-grensesnittet eller innlemmelse av ekstra vask trinnene under utarbeidelsen av microfluidic kan bidra til å unngå luftbobler.
Det anbefales at protokollen drives av to operatører hvor man forbereder cellene og andre forbereder microfluidic systemet og flyt analysen. Dette sikrer at ECs er belagt i microfluidic chips i en konstant-vinduet før behandling og forbedrer nøyaktigheten og reproduserbarhet resultatene. I tillegg kan dette også definere blendet eksperimenter å unngå skjevhet i resultatene.
For vellykket celle gjenkjenning med automatisert bildebehandlingen pipeline, er det viktig å hente bilder i fokus med en høy signal-til-støy-forhold og unngå autofluorescence av ikke-spesifikke objekter, for eksempel celle klumper. Avgjørende er riktig spesifikasjon av minimal og maksimal grensene for vanlig størrelse av tilhenger leukocytter som må identifiseres. Man kan beregne vanlig størrelse av leukocytter bruke et linje-måleverktøy i ImageJ. For eksempel i vår analyse brukte vi området 9 – 15 piksler som tilsvarer den fysiske størrelsen på 10,3-17.1 µm (figur 4C). Når du bruker et galt utvalg, f.eks 3 til 15 piksler (3,4-17.1 µm), en enkelt leukocytter identifiseres ikke som en celle, men heller sin kapittel identifiseres som separate objekter (Figur 4 d). Dette fører til falske antallet objekter identifiseres.
Mange objekter av svak og mindre arealet enn leukocytter kan oppdages ved hjelp av metoden gitt dynamisk terskelverdi. Dette kan ta sted på grunn av autofluorescence eller noen andre ikke-spesifikke fluorescerende signaler. Likevel, disse ikke-spesifikke objekter, området er lavere enn en enkelt leukocytter, typiske området kan filtreres ved å definere minimal akseptert areal (figur 4C).
Flyt analysen beskrevet her kan direkte vurdering av leukocytter vedheft til en EU-monolayer, Klargjørende samspillet mellom disse to cellen typer, men tar ikke hensyn til andre cellen skriver, som pericytes som er tilstede i vaskulære veggen og kan også delta i regulering av leukocytter bloduttredelse15. Integrere en 3D kultur microenvironment med andre celletyper kan forbedre fysiologiske relevansen av systemet. Til tross for disse begrensningene gir flyt analysen for vurdering av inflammatoriske svar beskrevet her et verdifullt verktøy for grunnleggende karakterisering og sykdom modellering programmer av hiPSC-ECs.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å erkjenne følgende tilskudd: europeiske Research Council (ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC); Nederland Organ-on-Chip initiativ, en NWO gravitasjon prosjektet finansiert av Kunnskapsdepartementet, kultur og vitenskap av regjeringen i Nederland (024.003.001).
Vena8 Endothelial+ biochip | Cellix Ltd | V8EP-800-120-02P10 | |
Mirus Evo Nanopump | Cellix Ltd | MIRUS-EVO-PUMP | 1 x syringe pump; 1 x VenaFluxAssay Software; 1 x tubing kit; power supply and cables. |
8-channel manifold MultiFlow8 | Cellix Ltd | MIRUS-MULTIFLOW8 | |
Humidified box | Cellix Ltd | HUMID-BOX | |
Fluorescence imaging system Leica AF6000 | Leica Microsystems | ||
Electron-multiplying charge-coupled device camera | Hamamatsu | C9100 | |
Biological safety cabinet/laminar flow-hood | Cleanair | ||
CO2 cell-culture incubator | Panasonic | MCO-170AICUV | |
Centrifuge | Hitachi | himac-CT6EL | |
Handheld pipetman (P-10 (10 mL), P-200 (200 µL), P-1000 (1,000 µL) | Gilson international | 4807 (10µl), 4810 (200µl), 4809 (1000µl) | |
Sterile plastic pipette | Greiner Bio-One | 606180 (5ml), 607180 (10ml) | |
Petri dish | VWR/ Duran Group | 391-0860 | |
Culture flasks (75 cm2) | CELLSTAR | 658,170 | |
Centrifuge tube (15 mL) | CELLSTAR | 188271 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
Fibronectin (Bovine plasma) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-169 | |
Human Endothelial-SFM | Life Technologies | 11111-044 | |
Human VEGF 165 IS, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-109-386 | |
Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-842 | |
Platelet-poor Plasma Derived Serum, bovine | Biomedical Technologies | BT-214 | |
Recombinant Human TNF-α | Tebu-bio | 300-01A-A | |
TrypLE Select | Life Technologies | 12563029 | |
DiOC6(3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 21875-034 | |
2-Mercaptoethanol (50 mM) | Life Technologies | 31350010 | |
FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
L-glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Life Technologies | 15070-063 | |
Distilled water | Life Technologies | 15230-089 | |
Ethanol absolute | Merck | 1.00983.2500 | |
VCAM-1 | R&D systems | FAB5649P | |
E-Selectin | R&D systems | BBA21 | |
ICAM-1 | R&D systems | BBA20 | |
Name | Company | Software version | Comments |
Cellrofiler | CellProfiler | 2.1.1 | |
VenaFluxAssay Software | Cellix Ltd | 2.3.a |