हम कैप्सूल उत्पादन के आधार पर बैक्टीरियल आबादी को अलग करने के लिए सतत घनत्व ढाल के उपयोग का प्रदर्शन । इस विधि के लिए संस्कृतियों के बीच कैप्सूल राशि की तुलना, एक विशिष्ट कैप्सूल phenotype के साथ म्यूटेंट अलग, या कैप्सूल नियामकों की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है. यहां वर्णित अनुकूलन और परख के चल रहा है ।
कैप्सूल कई बैक्टीरियल प्रजातियों में एक प्रमुख डाह कारक है, प्रतिरक्षा चोरी और विभिन्न शारीरिक तनाव के लिए प्रतिरोध मध्यस्थता. जबकि कई तरीकों और अलग उपभेदों या म्यूटेंट के बीच कैप्सूल उत्पादन की तुलना करने के लिए उपलब्ध हैं, वहाँ वे उत्पादन कितना कैप्सूल के आधार पर बैक्टीरिया छँटाई के लिए कोई व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि है. हम कैप्सूल राशि से बैक्टीरिया अलग करने के लिए एक विधि विकसित की है, एक सतत घनत्व ढाल का उपयोग कर. इस विधि के कैप्सूल मात्रा अर्द्ध मात्रात्मक संस्कृतियों के बीच तुलना करने के लिए प्रयोग किया जाता है, बदल कैप्सूल उत्पादन के साथ म्यूटेंट को अलग करने के लिए, और जटिल नमूनों से capsulated बैक्टीरिया को शुद्ध करने के लिए. इस विधि भी कैप्सूल विनियमन में शामिल जीन की पहचान करने के लिए transposon-सम्मिलन अनुक्रमण के साथ युग्मित किया जा सकता है । यहां, विधि विस्तार से प्रदर्शित किया जाता है, कैसे एक नया जीवाणु प्रजातियों या तनाव के लिए ढाल की स्थिति का अनुकूलन करने सहित, और कैसे निर्माण और घनत्व ढाल चलाने के लिए ।
कई जीवाणु प्रजातियों के एक polysaccharide कैप्सूल है, जो विभिन्न शारीरिक तनाव से बैक्टीरिया की कोशिका की रक्षा और मान्यता और प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा हत्या से बचाता है । Klebsiella निमोनियामें, कैप्सूल उत्पादन1,2संक्रमण के लिए एक निरपेक्ष आवश्यकता है । निमोनिया कैप्सूल रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स प्रतिरोध करने के लिए विरोध मध्यस्थता, पूरक मध्यस्थता की हत्या करने के लिए प्रतिरोध, phagocytosis की रोकथाम, और जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के दमन3. अतिरिक्त कैप्सूल उत्पादन वृद्धि हुई डाह और समुदाय के साथ जुड़ा हुआ है-अधिग्रहीत (बजाय nosocomial) संक्रमण4.
कैप्सूल उत्पादन की जांच करने के लिए मात्रात्मक और गुणात्मक परीक्षणों की एक श्रेणी उपलब्ध है । Klebsiella प्रजातियों के लिए, इन स्ट्रिंग परीक्षण5शामिल हैं, जिसमें एक दंर्तखोदनी एक कॉलोनी को छुआ ऊपर की ओर खींच लिया है और मापा उत्पादित स्ट्रिंग की लंबाई, और mucoviscosity परख6, जो की धीमी गति के केंद्रापसारक शामिल एक संस्कृति supernatant के ऑप्टिकल घनत्व को मापने के बाद । इन तरीकों सरल और जल्दी कर रहे हैं, लेकिन कमी संवेदनशीलता जब शास्त्रीय Klebsiella उपभेदों पर इस्तेमाल के बजाय कैप्सूल reproducing उपभेदों । कैप्सूल ठहराव की एक और विधि uronic एसिड परख है, जो तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है और केंद्रित सल्फर एसिड1के उपयोग की आवश्यकता है । अंत में, कैप्सूल सीधे माइक्रोस्कोपी (आंकड़ा 1a) द्वारा दिखाई देता है । इन तरीकों में से, केवल माइक्रोस्कोपी एक ही आबादी के भीतर अलग capsulation राज्यों का पालन करने के लिए उपयोगकर्ता की अनुमति देता है, और इन तरीकों में से कोई भी capsulated और गैर capsulated बैक्टीरिया की शारीरिक जुदाई सक्षम बनाता है ।
घनत्व आधारित जुदाई ढाल केंद्रापसारक द्वारा नियमित रूप से सेल जीवविज्ञान में इस्तेमाल के लिए विभिंन eukaryotic सेल7प्रकार शुद्ध कर रहे हैं, लेकिन शायद ही कभी सूक्ष्मजीवविज्ञानी अनुसंधान में प्रयोग किया जाता है । Klebsiella के लिए mucoviscosity परख अवलोकन पर आधारित है कि अत्यधिक capsulated बैक्टीरिया केंद्रापसारक द्वारा गोली करने के लिए और अधिक समय ले, और हम कारण है कि यह capsulated कोशिकाओं के कम समग्र घनत्व के कारण हो सकता है । यहां दिखाया विधि कैप्सूल राशि से शारीरिक रूप से अलग K. निमोनिया आबादी के लिए विकसित किया गया था, घनत्व ढाल केंद्रापसारक का उपयोग (चित्रा 1). यह विधि स्ट्रेप्टोकोकस निमोनियाके लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया था, यह दर्शाता है कि यह अन्य जीवाणु प्रजातियों के लिए लागू है । एक संतृप्त transposon उत्परिवर्ती पुस्तकालय transposon-सम्मिलन अनुक्रमण (घनत्व-TraDISort) के साथ युग्मित के घनत्व ढाल जुदाई कैप्सूल उत्पादन और विनियमन8में शामिल जीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । इसी प्रकार, इस विधि का उपयोग गैर-capsulated K. निमोनिया म्यूटेंट को अलग करने के लिए व्यक्तिगत कॉलोनियों के रैंडम-प्राइम पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) के साथ संयोजन के रूप में किया गया था । इस विधि भी विभिंन आबादी और शर्तों के बीच कैप्सूल उत्पादन की तेजी से तुलना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या जटिल नमूनों से capsulated बैक्टीरिया शुद्ध (आंकड़ा 1b) । अंत में, वहां परख अंय phenotypes कि इस तरह के सेल आकार या एकत्रीकरण के रूप में घनत्व को प्रभावित करने का विकल्प है ।
इस पांडुलिपि को दर्शाता है कि कैसे एक नए जीवाणु प्रजातियों या तनाव के लिए प्रक्रिया का अनुकूलन करने के लिए और निर्माण दर्शाता है और एक सतत घनत्व ढाल के चलाने के लिए हाइपर अलग-capsulated, capsulated और गैर capsulated बैक्टीरिया ।
कैप्सूल K. निमोनिया3, स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया9, Acinetobacter10, और नेइसेरिया11 प्रजातियों सहित कई जीवाणु प्रजातियों में एक महत्वपूर्ण डाह कारक है । हालांकि विभिन्न तरीकों ठहराव और बैक्टीरियल कैप्सूल के दृश्य के लिए मौजूद हैं, वर्तमान में वहाँ कोई व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है शारीरिक रूप से अलग capsulated और गैर-capsulated कोशिकाओं के लिए विधि. इस अनुच्छेद में, हम कैप्सूल के लिए एक मजबूत विधि-बैक्टीरियल आबादी की जुदाई आधारित है, विभिंन नदी के नीचे या बहाव प्रोटोकॉल के साथ संयोजन के रूप में कई संभावित अनुप्रयोगों के साथ प्रदर्शन किया है ।
एक सतह कैप्सूल की उपस्थिति बैक्टीरियल कोशिका घनत्व को कम कर सकते हैं, जो घनत्व ढाल केंद्रापसारक (चित्रा 2डी) द्वारा जुदाई की अनुमति देता है । हम में इस विधि की पुष्टि की है K. निमोनिया NTUH-K204412 औरATCC43816 13 के रूप में अच्छी तरह के रूप में स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया 23F में14 और उसके Δसीपीएस उत्परिवर्ती15. इस विधि घनत्व ढाल के मुख्य घटक के रूप में16 Percoll का उपयोग करता है, जो लेपित कोलाइडयन सिलिका कणों कि कम चिपचिपापन और बैक्टीरिया की दिशा में कोई विषाक्तता है-सिद्धांत में, अंय पदार्थों की बैठक इन मानदंडों की जा सकती का निलंबन है घनत्व ढाल स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया ।
यह सुनिश्चित करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है कि विभिन्न घनत्व की परतों मिश्रण नहीं है जब घनत्व ढाल का निर्माण, और अगर मिश्रण होता है, जुदाई विधि साफ परिणाम नहीं दे देंगे. हम ढाल डालने के लिए दो वैकल्पिक तरीकों को शामिल किया है, एक सुई या एक पिपेट का उपयोग-दोनों प्रभावी हैं, और जो विधि का उपयोग करने के लिए बस वरीयता की बात है. सभी कदम है कि एक पदार्थ pipetting शामिल करने के लिए (या तो एक बैक्टीरियल निलंबन, या एक और अधिक पतला ढाल परत) एक ढाल परत के ऊपर, pipetting छोटे संस्करणों के कई aliquots यह आसान परतों के किसी भी मिश्रण के बिना एक तेज अंतरफलक को प्राप्त करने के लिए कर सकते हैं ।
इस प्रोटोकॉल की एक सीमा है कि अंय जीवाणु प्रजातियों के साथ अपने प्रदर्शन की गारंटी नहीं किया जा सकता है । इसलिए, यह महत्वपूर्ण है जब एक नए जीवाणु प्रजातियों या तनाव की जांच के लिए घनत्व आधारित जुदाई एक अतिरिक्त, स्वतंत्र कैप्सूल ठहराव विधि का उपयोग कर पुष्टि । उपयुक्त कैप्सूल दाग के साथ सूक्ष्म द्वारा प्रत्येक अंश में मौजूद बैक्टीरिया visualizing जो विस्तृत प्रोटोकॉल उपलब्ध है17के लिए एक विश्वसनीय विधि है । वैकल्पिक रूप से, uronic एसिड युक्त कैप्सूल (जैसे ई कोलाई और K. निमोनियाके उन के रूप में) एक विशिष्ट परख द्वारा quantified जा सकता है के रूप में चित्रा 2बी1में दिखाया गया है । इस केंद्रापसारक आधारित mucoviscosity परीक्षण एक स्वतंत्र सत्यापन विधि के रूप में उपयुक्त नहीं है, के रूप में इस परख भी बैक्टीरियल कोशिकाओं के घनत्व पर निर्भर करता है ।
इस विधि की एक और सीमा है कि कैप्सूल उत्पादन बहुत संस्कृति की स्थिति के प्रति संवेदनशील है, और विकास के लिए भी छोटे परिवर्तन मध्यम, तापमान, या वातन इस परख के परिणामों को प्रभावित कर सकता है । इस समस्या को कम करने के लिए, शोधकर्ताओं का उपयोग कर सकते हैं एक परिभाषित वृद्धि मध्यम या एक बैच-संगत जटिल माध्यम, अन्य सभी वृद्धि पैरामीटर प्रयोगों के बीच समान रखें, और अप्रत्याशित परिणामों की व्याख्या को सक्षम करने के लिए उपयुक्त नियंत्रण उपभेदों शामिल . कुछ बैक्टीरियल कैप्सूल नाजुक है और कोशिका से दूर कतरनी कर सकते है जब संस्कृतियों pipetted हैं । कैप्सूल के बाल काटना से बचने के लिए, संस्कृतियों और शुरू कर दिया जाना चाहिए नहीं ढाल पर लदान के लिए तैयारी के दौरान दो बार से अधिक resuspend । यदि संस्कृतियों की एकाग्रता के दौरान कैप्सूल की हानि समस्याग्रस्त रहता है, बैक्टीरियल संस्कृतियों एक घनत्व ढाल सीधे लागू किया जा सकता है, बैक्टीरियल निलंबन की एक बड़ी मात्रा के साथ जोड़ा यदि दृश्य के लिए आवश्यक है ।
इस विधि के भविष्य अनुप्रयोगों के लिए यह अन्य जीवाणु प्रजातियों के लिए लागू होते हैं, और विभिन्न नदी के नीचे और बहाव प्रौद्योगिकियों के साथ संयोजन के रूप में इस जुदाई का उपयोग करने के लिए. घनत्व के अलावा-TraDISort8, हम सुझाव है कि capsulated बैक्टीरिया के घनत्व ढाल जुदाई बदल कैप्सूल के साथ म्यूटेंट के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, मिश्रित संस्कृतियों या जटिल नमूनों से capsulated कोशिकाओं के शोधन के लिए, और के लिए कई उपभेदों में कैप्सूल उत्पादन की तेजी से profiling । अंत में, इस तकनीक को एकत्रीकरण जैसे अन्य जीवाणु phenotypes की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
हम जिन-शहर वांग और ट्विटर साल्टर की आपूर्ति उपभेदों के लिए धंयवाद, और उपयोगी विचार विमर्श के लिए Parkhill समूह के सदस्य हैं । यह काम वेलकम ओरिजिनल इंस्टिट्यूट (वेलकम ग्रांट २०६१९४) द्वारा वित्त पोषित किया गया था, और एक सर हेनरी वेलकम postdoctoral फेलोशिप से F.L.S. (ग्रांट 106063/ M.J.D. को वेलकम सैंज इंस्टीट्यूट पीएचडी की छात्राओं ने सपोर्ट किया है ।
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
Centrifuge 5810R with Rotor A-4-81 and 500ml buckets | Eppendorf | 5810 718.007 | |
Adapters for 15ml tubes | Eppendorf | 5810 722.004 | |
Fixed andgle rotor F-34-6-38 | Eppendorf | 5804 727.002 | |
2.6 – 7ml tube adapter | Eppendorf | 5804 739.000 | |
Centrifuge 5424 including Rotor FA-45-24-11 | Eppendorf | 5424 000.460 | |
2ml tubes | Eppendorf | 0030 120.094 | |
1.5ml tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
5ml polypropylene round bottom tube | Falcon | 352063 | |
1ml disposable syringe Luer slip | Becton Dickinson | 300013 | |
AGANI Needle 21G Green x 1.5" | Terumo | AN 2138R1 | |
P1000 pipette and tips | |||
P200 pipette and tips |